引用本文
夏飞, 屈磊, 胡海涛, 杨芳, 曾群利, 刘海朝, 方瑶, 毛旭虎. 类鼻疽伯克霍尔德菌经鼻感染BALB/c小鼠模型的构建与评价[J]. 中国热带医学, 2022,22(10): 923-929.
XIA Fei, QU Lei, HU Hai-tao, YANG Fang, ZENG Qun-li, LIU Hai-chao, FANG Yao, MAO Xu-hu. Establishment and evaluation of a BALB/c mouse model of Burkholderia pseudomallei via nasal infection [J]. China Tropical Medicine, 2022,22(10): 923-929.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.10.07
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类鼻疽伯克霍尔德菌经鼻感染BALB/c小鼠模型的构建与评价
夏飞1, 屈磊1, 胡海涛1, 杨芳1, 曾群利1, 刘海朝1, 方瑶1,*, 毛旭虎2
1.中部战区总医院呼吸与危重症医学科,湖北 武汉 430070
2.陆军军医大学药学院&医学检验系临床微生物及免疫学教研室,重庆 400038
*通信作者：方瑶,E-mail: 371095902@qq.com

作者简介：夏飞（1978—）,男,本科,主治医师,研究方向：重症感染和呼吸内镜治疗。

收稿日期: 2022-04-13
基金资助: 2019年度军队后勤科研计划面上项目（No. CLB19J029）; 2020年武汉市中青年医学骨干人才工程
摘要

目的 构建类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei, BP）经鼻感染BALB/c小鼠动物模型,为后续类鼻疽菌的毒力研究和急性类鼻疽的致病机制研究提供可靠的动物模型。方法 采用经鼻主动吸入的感染途径,通过大体解剖、组织病理和组织匀浆计数菌落等方法观察类鼻疽伯克霍尔德菌感染小鼠的病理生理反应、脏器病理损伤和细菌定植情况,分析急性类鼻疽感染小鼠模型的生物学特征,并比较致病性类鼻疽临床株与非致病性类鼻疽泰国株（伯克霍尔德菌）感染BALB/c小鼠的不同表现。结果 急性类鼻疽菌经鼻感染模型中,BALB/c小鼠死亡多集中在感染后第3到第5天,3×105~3×106 CFU可作为急性类鼻疽BALB/c小鼠病死模型的合适攻毒剂量,而半数致死量约在3×104~3×105CFU。大体解剖和组织HE染色均可见肺脏、脾脏和肝脏组织中形成脓肿或坏死病灶,其中在脾脏最明显,并与攻毒剂量呈正相关。类鼻疽菌感染的小鼠血液、肺脏、脾脏及肝脏中均发现类鼻疽菌定植,且定植量与组织特异性有关,血液中分离到的活菌浓度最高[Log2对数值：（10.28±0.34） CFU/mL],定植总量最高的脏器是肺脏[Log2对数值：（7.54±2.11） CFU]。虽然类鼻疽伯克霍尔德菌与伯克霍尔德菌株在细胞水平上的生物学效应类似（多核巨细胞形成、胞内增殖等）,但是对BALB/c小鼠的毒性差异显著。伯克霍尔德菌即使在高剂量（8×107CFU）时对小鼠仍是非致死性的,而且无法在小鼠脏器中有效定植。结论 成功构建了经鼻吸入性感染BALB/c小鼠的急性类鼻疽动物模型,明确了类鼻疽菌造成的组织病理损伤特点,发现了类鼻疽伯克霍尔德菌与伯克霍尔德菌株在动物水平上的显著生物学差异。

关键词: 类鼻疽伯克霍尔德菌; 经鼻感染; 动物模型
中图分类号:R378 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)10-923-07
Establishment and evaluation of a BALB/c mouse model of Burkholderia pseudomallei via nasal infection
XIA Fei1, QU Lei1, HU Hai-tao1, YANG Fang1, ZENG Qun-li1, LIU Hai-chao1, FANG Yao1, MAO Xu-hu2
1. Department of Respiratory and Critical Care Medicine, General Hospital of Center Theater of PLA, Wuhan, Hubei 430070, China
2. Department of Clinical Microbiology and Immunology of the College of Medical Laboratory Science, Army Military Medical University, Chongqing 400038, China
Corresponding author: FANG Yao, E-mail: 371095902@qq.com
Abstract

Objective To establish an animal model of BALB/c mice infected with Burkholderia pseudomallei through the nose (inhalation route), provides a reliable animal model for the follow-up studies on the virulence of melioidosis and the pathogenesis of acute melioidosis.Methods The experiment was carried out through infecting with Burkholderia pseudomallei through the nose (inhalation route). The pathophysiological response, visceral pathological damage and bacterial colonization of the mice infected with Burkholderia pseudomallei were observed by gross anatomy, histopathology and tissue homogenate count, and the biological characteristics of the mouse model of acute melioidosis were analyzed accordingly. Then we compared the physiological responses in BALB/c mice between the Burkholderia pseudomallei and non-pathogenic Burkholderia thailandensis.Results In the model of acute nasal infection with Burkholderia thailandensis, most death happened between the 3rd to 5th day after infection, 3×105-3×106 CFU was the suitable dose for acute fatal melioidosis model of BALB/c mice, and the medium lethal dose was about 3×104-3×105 CFU. Both gross anatomy and tissue HE staining showed that abscesses or necrosis were found in the lung, spleen and liver, especially in the spleen and lung, which was positively correlated with the challenge dose. Viable bacteria was isolated from the blood, lung, spleen and liver of Burkholderia pseudomallei-infected mice, and the bacteria account colonization was related to tissue specificity. The concentration of live bacteria isolated from in the blood was the highest [Log2value: (10.28±0.34) CFU/mL], and the organ with the maximum quantity of bacteria was the lung [Log2 value: (7.54±2.11) CFU/total organ]. It has been reported that the biological effects of Burkholderia pseudomallei and its homologous non-pathogenic Burkholderia thailandensis were similar at the cellular level, like multi-nuclear giant cell formation and active intracellular replication, while it is still unclarrified in the differences of virulence in mice. In this study, it was proved that Burkholderia thailandensis was not fatal to mice even at a high dose (8×107CFU), or detected from mice infected with it via nasal.Conclusion We successfully established a reliable BALB/c mouse model (acute lethal model) of melioidosis via nasal infection, described its biological characteristics, and identified the different biological responses between Burkholderia pseudomallei and its homologous non-pathogenic Burkholderia thailandensis in mice.

Keyword: Burkholderia pseudomallei; inhalation route; mouse model

类鼻疽伯克霍尔德菌（简称类鼻疽菌, Burkholderia pseudomallei, BP）是一种革兰氏阴性的短杆菌, 属人兽共患病原体, 流行分布于热带及亚热带地区, 我国海南、广西、广东、香港、台湾等地是类鼻疽的高发地区[1, 2, 3]。2016年自然-微生物杂志（Nature Microbiology）第1期文章重点报道了类鼻疽的全球流行形势, 估算2015年全球类鼻疽罹患人数可能超16万人, 死亡人数8.9万[2]。类鼻疽菌的主要感染途径为气溶胶吸入或经破损的皮肤感染, 人群对类鼻疽菌普遍易感, 感染可累及多种组织器官, 以肺炎、败血症病死率最高（20%以上）, 也是人类鼻疽病的主要死因[4, 5], 因而, 经呼吸道感染的急性类鼻疽动物模型的研究尤为重要。小鼠是研究类鼻疽最常用的模式动物[6, 7], 鉴于目前国内尚无类鼻疽菌急性感染动物模型方面的研究报道, 参考课题组前期成功构建类鼻疽慢性感染模型的经验做法[8], 本文报道了类鼻疽伯克霍尔德菌经鼻感染BALB/c小鼠模型的构建, 分析不同类鼻疽菌亚种的毒性差异, 为后续类鼻疽的致病机制研究、疫苗研发和药物评价奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 菌株及细胞 类鼻疽感染试验所用菌株由本课题组实验室保存, 是经海南省三亚市人民医院检验科分离鉴定的临床类鼻疽菌株（编号：BPC006）, 并经全基因组测序（登录号：CP003781、 CP003782）和多位点序列分型（ST70）, 可作为类鼻疽菌研究的标准菌株[9]。非致病性伯克霍尔德菌株（ATCC编号：E264）, 也称类鼻疽伯克霍尔德菌泰国株（简称伯克霍尔德菌, Burkholderia thailandensis, B. thailandensis, BT）, 购自美国ATCC公司, 本实验室保存。小鼠巨噬细胞RAW264.7（ATCC：TIB-71）购自于中科院上海细胞库, 本室保存。所有涉及活菌的实验操作均在P2+类鼻疽实验室进行。

1.1.2 实验动物及生物安全 SPF级、6~8周龄、体质量18~20 g的雌性BALB/c小鼠由陆军军医大学实验动物中心提供。动物实验在陆军军医大学类鼻疽实验室进行, 实验方案得到陆军军医大学和中部战区总医院伦理委员会及实验动物管理和使用委员会的批准, 符合中国动物实验的福利伦理准则, 并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。所有涉及类鼻疽菌病原及动物试验均在陆军军医大学“ 类鼻疽菌研究P2+实验室” 完成, 该实验室具有生物安全二级实验室（BSL-2）资质, 可以充分保障参与病原操作的人员及环境的安全。

1.1.3 试剂及耗材 Luria-Bertani（LB）培养基所需酵母提取物和蛋白胨购自美国Sigma公司; 生物梅里埃API鉴定系统购自法国生物梅里埃公司; 吉姆萨染色液购自南京鼎国生物科技有限公司; 菌落计数仪（HXK-V1）购自杭州迅数科技有限公司; PBS缓冲液（AR0030）购自武汉博士德公司; 0.1% Triton X-100（T8787）购自美国Sigma公司; DMEM培养液（11965-092）、胎牛血清（10099-141）购自美国GBICO公司; Thermo二氧化碳细胞培养箱购自美国Forma公司; 奥林巴斯（Olympus）倒置显微镜购自北京百赛盛科技有限公司; 16s rDNA PCR鉴定试剂盒购自上海生工（B532063）; HE染液和吉姆萨染色试剂购自北京中杉金桥公司; 4%多聚甲醛等国产分析纯试剂购自国药集团。

1.2 方法

1.2.1 活菌的培养与制备 复苏类鼻疽菌株（BPC006）, 划线接种于LB琼脂平板, 37 ℃条件下培养12 h, 挑取单个菌落, 接种于LB液体培养基中, 37 ℃、220 r/min恒温摇床培养12 h, 12 000 r/min（离心半径10 cm）, 离心后弃去上清, 再以10 mmol/L的灭菌PBS洗涤2次, 最后以灭菌PBS重悬菌体, 测定其光密度值（OD600）。根据光密度值与CFU标准曲线, 调整菌液浓度至要求浓度（3×108、3×107、3×106、3×104、3×103CFU /mL）。同样方法, 复苏伯克霍尔德菌（E264）, 调整菌液浓度至所需浓度。

1.2.2 攻毒剂量的摸索 将BALB /c小鼠采用单纯随机抽样的方法分为6组, 每组10只, 其中实验组（BP）5组, 对照组（PBS）1组。给予充足的饮水和饲料, 定期更换垫料。使实验组小鼠分别自主吸入 10 μ L含菌PBS溶液（菌液浓度分别为3×108、3×107、3×106、3×104、3×103CFU/mL, 菌量则分别为3×106、3×105、3×104、3×102、30 CFU）, 对照组小鼠吸入等体积的灭菌PBS。每天定时观察并记录小鼠的生存状况, 观察时间为最长为30 d, 急性致死模型的观察时间为1周。根据所记录数据, 绘制小鼠生存曲线。

1.2.3 小鼠感染模型的评价 模型主要从大体解剖、组织病理和细菌定植等方面进行评价, 评估模型的稳定性和细菌定植致病能力, 比较不同菌株在小鼠感染模型中的不同反应性。本实验对成功定植感染的定义为：在急性感染模型中（1周内）若小鼠死亡因该菌所致, 视为感染致死; 从血液、肺脏、肝脏或脾脏中分离培养到感染细菌, 也视为成功感染; 小鼠未死亡, 亦未从其体液或组织中分离到感染细菌, 但可见明显大体或微观组织病理损伤, 可视为可疑感染; 以上情形均无, 可考虑感染病原被小鼠免疫系统所清除, 提示感染失败[8]。且受感染的小鼠脏器及血液组织均经过细菌培养和PCR测序鉴定, 证实为有活力的类鼻疽菌感染小鼠导致。

1.2.3.1 病理学检测 小鼠感染后特定时间点给小鼠实施安乐死（二氧化碳麻醉）, 在无菌条件下取小鼠肺脏、肝脏和脾脏, 固定于4％多聚甲醛溶液中, 进行HE染色, 于光学显微镜下观察组织的病理学改变。通过大体解剖和切片观察, 分析类鼻疽菌感染小鼠后其脏器病理损伤及特点。其中, 脏器脓肿形成率=（每组受试小鼠肺脏肉眼或HE染色时可见脓肿的只数/总的受试小鼠的只数）×100%。

1.2.3.2 细菌定植检测 涂板计数小鼠血液、肝脏、脾脏和肺脏类鼻疽菌定植量。小鼠感染后2d分别取各组存活小鼠3~5只, 同时随机抽样取对照组小鼠2只, 实施安乐死, 并在无菌条件下实施眼球取血（最多获取2 mL）, 同样无菌条件下取肺脏、脾脏和肝脏, 用玻璃匀浆器磨碎, 倍比稀释后涂于LB琼脂平板, 置于培养箱中培养, 利用菌落计数仪计数菌落数, 计算脏器中类鼻疽菌的定植总量。并利用16s-rDNA PCR测序方法随机抽取菌落进行鉴定, 排除污染菌。16s-rDNA PCR测序引物：F-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG, R-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC, 克隆序列长约1 500 bp, 实验步骤16s rDNA PCR鉴定试剂盒说明书执行, PCR产物或者电泳条带送至上海生工上机测序, 截取目的序列在线BLAST检索确认是否为试验病原菌16S-rDNA片段。

1.2.4 细菌感染细胞实验[10] 参照文献[10], 将RAW264.7细胞接种于六孔板内, 每孔约1×106个细胞, 37 ℃, 5% CO2细胞培养箱内培养, 单层细胞生长密度达到70%以上进行后续感染实验。取感染复数（MOI=细菌/细胞）为10的菌量接种于六孔板内, 37 ℃, 离心（170 ×g, 5 min）, 孵育1 h, 37 ℃预温的PBS洗涤2次, 加入含250 μ g/mL卡那霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。取感染不同时间的细胞爬片, 使用多聚甲醛固定3~5 min, 干燥后用吉姆萨染色3~5 min, 每块盖玻片上至少要有1 000个细胞核, 观察细胞病理改变和细菌的胞内增殖。多核巨细胞（multinuclear giant cell, MNGC）是类鼻疽菌感染后宿主细胞最显著的形态特点, 可作为类鼻疽菌成功感染宿主细胞的标志, MNGC形成率=[（多核巨细胞中的核数）/（总的核数）]×100%, MNGC形成率可间接反映该菌胞内增殖活跃程度[11, 12]。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0统计数据, 计数资料用百分率表示; 计量资料用$\bar{x}±s$表示, 采用t检验比较组间差异, P<0.05提示差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 攻毒方法

将小鼠固定在剪去管底的50 mL离心管中, 使用10~20 µ L移液器将5~10 µ L菌液缓慢推出移液Tip头, 使液滴随着小鼠自主呼吸动作顺势吸入, 可分次完成吸入接种以减少小鼠喷嚏反射和呛咳情况。试验全程在类鼻疽实验室内2级生物安全柜中进行, 气流经高效过滤系统除菌过滤后再排出。见图1。

图1 类鼻疽菌感染小鼠模型攻毒方式Fig. 1 Inoculation of B. pseudomallei on BALB/c mice

2.2 攻毒剂量

不同剂量的类鼻疽菌（从高到低分别为3×106、3×105、3×104、3×102、30 CFU, PBS对照）感染BALB /c小鼠, 生存曲线如图2所示。可见, 在3×105~3×106 CFU感染BALB/c小鼠时, 小鼠5 d内全部死亡; 3×102~3×104 CFU感染时小鼠于第6天开始相继间隔一定时间病死, 但直至观察结束仍有半数以上小鼠存活; 攻毒剂量更低时（30 CFU）, 观察结束时仍无小鼠死亡, 对照组（吸入PBS缓冲液）小鼠均存活。提示攻毒剂量3×105~3×106 CFU是类鼻疽菌感染BALB /c小鼠的致死性剂量, 而攻毒剂量在102数量级时更适利于构建慢性类鼻疽菌感染BALB /c小鼠模型。

图2 不同攻毒剂量类鼻疽菌感染小鼠生存率分析Fig. 2 Survival curve of mice infected with B. pseudomallei in different doses

2.3 类鼻疽菌感染BALB/c小鼠的病理特征

选择致死剂量3×106 CFU类鼻疽菌感染小鼠, 每隔2~4 h观察小鼠存活情况, 最终小鼠均在1周内死亡, 死亡小鼠被及时解剖。大体解剖结果发现（图3A、图3D、图3G）, 类鼻疽菌感染致死的小鼠脏器中形成了明显的细菌性脓肿, 以肺脏和脾脏脓肿形成几率最高。肺脏脓肿直径较大, 肉眼可见, 约4~5 mm; 肝脏脓肿直径较小, 约1 mm。HE染色结果可见（图3B）, 肺脏脓肿内部多为坏死组织, 间质、血管内可见大量炎性细胞浸润。脾脏切片HE染色可见散在的多发坏死病灶, 还可见多个生发中心形成（图3E）。肝脏病变以小片状坏死为主, 伴血管内充血、白细胞聚集, 肝脏正常小叶结构破坏（图3H）。进一步选择不同攻毒剂量感染小鼠时发现, 攻毒剂量越高, 大体解剖肉眼可见的肺脏脓肿形成越明显, 脓肿直径也越大（图3C）。较低剂量（3×102 CFU）类鼻疽菌攻毒时, 也能在较多小鼠（37.5%, 3/8）脾脏中观察到脓肿形成, 随着攻毒剂量增加时, 脾脏脓肿形成也更明显（图3F）。但肝脏脓肿形成规律并不明显, 需要较高的攻毒剂量（3×104 CFU）, 高剂量（3×108 CFU）类鼻疽菌攻毒时其脓肿形成比率也不高（25%, 2/8）, 仍以小片状坏死灶为主（图3G、3I）。

图3 类鼻疽菌感染小鼠脏器急性病理损伤及脓肿形成
红色箭头提示大体解剖和组织病理中形成的脓肿病灶。Fig. 3 Pathological characteristics and abscess formation of mice infected by B. pseudomallei
 Red arrows indicate abscess-formation in the organs.

2.4 比较类鼻疽菌与伯克霍尔德菌感染宿主细胞和小鼠的生物学特点

使用相等量的病原菌感染巨噬细胞RAW264.7, 吉姆萨染色下可见类鼻疽菌与伯克霍尔德菌都可在细胞内快速复制, 诱导宿主细胞相互融合形成多核巨细胞（图4）。

图4 类鼻疽伯克霍尔德菌和伯克霍尔德菌诱导多核巨细胞形成
A. 类鼻疽菌感染细胞8 h; B. 类鼻疽菌感染细胞24 h; C. 伯克霍尔德菌感染细胞8 h; D. 伯克霍尔德菌感染细胞24 h; 实线箭头指细菌, 白色箭头指多核巨细胞; 吉姆萨染色。Fig. 4 Formation of multinucleated giant cells induced by Burkholderia pseudomallei and Burkholderia
A. Cells were infected with B. pseudomallei for 8 h; B. Cells were infected with B. pseudomallei for 24 h; C. Cells were infected with Burkholderia for 8 h; D. Cells were infected with Burkholderia for 24 h; Solid arrows refer to bacteria, and white arrows refer to multinucleated giant cells; Giemsa staining.

进一步比较两者在感染BALB /c小鼠上的毒力差异, 实验组（每组8只）接种了较低剂量（3×104 CFU）的类鼻疽菌, 1周内有2只小鼠死亡（25%）; 对照组（每组8只）接种高剂量（8×107 CFU）伯克霍尔德菌, 1周直至观察30 d时均无小鼠死亡（图5A）。感染1周时取两组存活的3~5只小鼠进行CO2麻醉处死, 取受感染小鼠脏器进行大体解剖和组织HE染色, 发现类鼻疽菌感染的小鼠解剖时可见脾脓肿形成, HE染色可见肺脏、脾脏和肝脏间质及血管中有明显炎性细胞的渗出和浸润, 局部可见坏死病灶（图5B）。而伯克霍尔德菌感染的小鼠无论在大体解剖还是组织切片HE染色中均无肉眼可见脓肿病灶或明显炎性细胞聚集, 仅在肝脏切片局部发现少许炎性细胞浸润（图5B）。可见, 类鼻疽菌对BALB/c小鼠是致死性的, 伴随着脏器的炎性损伤, 而伯克霍尔德菌对BALB /c小鼠则是非致死性的, 病理损害较轻。

图5 类鼻疽菌和伯克霍尔德菌对BALB/c小鼠毒性对比（HE染色, ×200）Fig. 5 Comparison of the toxicity of B. pseudomallei and B. thailandensis to BALB/c mice (HE staining, ×200)

2.5 比较类鼻疽菌与伯克霍尔德菌在小鼠脏器的感染定植情况

经鼻接种3×104 CFU类鼻疽菌、8×107 CFU伯克霍尔德菌, 经尾静脉注射接种8×107 CFU伯克霍尔德菌, 分别感染BALB/c小鼠（每组8只）, 7 d内类鼻疽菌组2只小鼠死亡, 伯克霍尔德菌组无小鼠死亡, 尾静脉接种伯克霍尔德菌组有1只小鼠死亡。脏器组织经匀浆处理后, 倍比稀释涂布于血琼脂平板上, 培养24 h后计数菌落数量（经PCR鉴定为类鼻疽菌）, 计算类鼻疽菌组织定植总量。结果显示, 类鼻疽菌在血液（按1 mL计算）和肺脏中的定植量最高, Log2对数值分别为（10.28±0.34）CFU/mL、（7.54±2.11） CFU, 两者之间差异无统计学意义（P>0.05）, 脾脏及肝脏的定植量较低（P<0.05）, Log2对数值分别为（3.21±2.83）和（2.21±3.84） CFU。而伯克霍尔德菌经鼻感染小鼠体内均未发现病原菌的定植, 即使通过尾静脉注射接种伯克霍尔德菌, 也仅能从小鼠血液中分离培养到该菌, 组织脏器中无该菌定植（图6）。

图6 类鼻疽菌与伯克霍尔德菌攻毒后脏器定植情况的比较
Ⅰ.肺脏; Ⅱ .脾脏; Ⅲ . 肝脏; Ⅳ.血液; * .P<0.05。Fig. 6 Comparison of colonization in mice between B. pseudomallei and B. thailandensis
Ⅰ. Lungs; Ⅱ . Spleen; Ⅲ . Liver; Ⅳ. Blood; * .P<0.05。

3 讨论

类鼻疽菌感染人体的途径很多, 包括经气溶胶吸入、经破损皮肤黏膜侵入、经消化道感染等等, 引起的人类鼻疽病临床表现多样, 病死率极高, 而且临床误诊和漏诊常见[13]。近年来, 类鼻疽在热带及亚热带流行国家及地区的流行形势已经获得公共卫生部门和研究人员的广泛关注, 在非疫源地也陆续出现散发或输入性病例报道[14, 15, 16]。

动物模型是研究类鼻疽菌感染与免疫机理的直接工具, 国内报道类鼻疽感染动物及相关模型的研究很少, 国外文献报道, 小鼠、豚鼠、大鼠、雪貂、家兔、山羊和猕猴等动物都曾用于构建类鼻疽菌感染模型[17, 18]。其中, 小鼠是应用得最多的一种哺乳动物, 其接种方式也有多种方法, 包括小鼠尾静脉注入、皮下接种、腹腔接种、经鼻滴入和气溶胶吸入等等。既往研究认为, 类鼻疽菌主要通过消化道和接触方式感染, 但近年来的病例报道及研究提示, 经呼吸道感染是类鼻疽肺炎的主要感染途径, 而经气溶胶传播正是类鼻疽疫情暴发的重要原因, 因而吸入方式感染的类鼻疽动物模型研究也越来越得到青睐[19, 20, 21]。经小鼠呼吸道的攻毒方式主要包含两种, 气溶胶和滴鼻感染, 两者各有优缺点[22, 23]。前者优点是定量精确, 能精确计算病原菌摄入量, 可以测定病原菌气溶胶粒子大小与肺部沉积效果, 但试验需要昂贵、复杂的气溶胶动物暴露机器, 有气溶胶颗粒逸出风险, 可能对实验室造成污染, 威胁生物安全。后者操作简便, 节约时间, 不需要特殊仪器, 所有操作都可在生物安全柜中进行, 缺点是无法精确定量沉积到肺脏深部的病原颗粒数量。综合考虑试验条件和生物安全性, 我们优化了滴鼻感染方式, 通过小鼠自主呼吸动作使其主动吸入菌液微滴, 建立了简便的经鼻主动吸入感染的类鼻疽小鼠模型。优点是可以模拟吸入感染方式, 可避免菌液过多进入消化道, 易于操作, 弊端在于小鼠可能会有喷嚏反射, 需要补充损失量。

观察小鼠感染实验发现, 只有当类鼻疽菌攻毒剂量达到一定数量级时, 其感染小鼠后才会致病、致死[8]。国外研究报道, 类鼻疽菌感染BALB/c小鼠的半数致死率多在103~104数量级[18, 24], 本研究中攻毒剂量在3×105~3×106 CFU时BALB/c小鼠感染1周内小鼠全部死亡, 但死亡时间并无明显规律, 与小鼠个体免疫清除能力有关。最终我们选择3×105~3×106 CFU类鼻疽菌接种感染BALB/c小鼠制备急性致死模型, 因为在此攻毒剂量情况下小鼠均在1周内死亡, 符合急性感染致死案例临床表现。而3×104CFU剂量攻毒时小鼠在1个月内死亡率不超过50%, 估算该类鼻疽菌临床株（BPC006）的半数致死量在3×104~3×105CFU之间, 这也与前期我们研究模型中的结论相一致[8], 但较国外报道的K96243、1026b等类鼻疽菌株的毒力要弱[5, 8, 25]。进一步研究发现, 类鼻疽菌经鼻吸入感染后能够播散至血液, 可定植到小鼠的肺脏、脾脏和肝脏组织中, 能形成典型的脓肿性病灶。而且脓肿形成率和病原的攻毒剂量有关, 也可作为急性类鼻疽小鼠模型构建成功的解剖标志。从脓肿形成规律看, 脾脏较肺和肝脏更易形成脓肿, 但肺脓肿病灶的直径更大, 肝脓肿则多为小的片状坏死灶。既往研究显示脾脏对于类鼻疽菌的组织亲和力可能更强, 脾脏定植可能与类鼻疽菌的慢性潜伏性感染有关[1, 26, 27], 但类鼻疽菌经吸入感染后播散入血的方式目前还不清楚, 吸入后是直接突破血气屏障经肺血管进入体循环还是通过局部定植、增殖后再入血, 还有待进一步深入研究。

伯克霍尔德菌是类鼻疽伯克霍尔德菌泰国株（临床减毒株）的别名, 基因组分析提示两者遗传背景高度同源, 且细胞内生物学行为相似[28, 29, 30]。前期研究证实, 类鼻疽菌与伯克霍尔德菌都可导致宿主细胞形成多核巨细胞, 都具有细胞毒性, 诱导巨噬细胞分泌TNF-α, 并诱导宿主细胞凋亡, 但对其在动物水平上的毒性差异无深入研究[13]。作为研究类鼻疽菌的明星替代品, 伯克霍尔德菌在病原结构、遗传基础和细胞病理方面与类鼻疽菌表现出良好的相似性。有研究者建议可将伯克霍尔德菌（泰国株）作为类鼻疽伯克霍尔德菌的模式细菌, 开展类鼻疽的致病机制、药物及疫苗相关研究[26, 27]。但前期我们已经发现类鼻疽菌和伯克霍尔德菌胞内感染免疫机理仍有明显差异[13], 本研究则提示两者在动物水平上存在着更大差异。3×104CFU的类鼻疽菌即可导致小鼠近半数的死亡, 而高剂量（5×106 CFU或者8×107 CFU）的伯克霍尔德菌对小鼠是非致死性的, 也不能有效定植于小鼠脏器, 即使经尾静脉注射高剂量伯克霍尔德菌, 也仅能在血液中检出该菌, 提示伯克霍尔德菌作为类鼻疽伯克霍尔德菌研究的模式菌应用范围可能有限。至此, 本研究利用简便的实验方法, 通过大体解剖和微观病理阐述了类鼻疽伯克霍尔德菌感染BALB/c小鼠的病理生理特征, 成功构建了经鼻吸入性感染BALB/c小鼠的急性类鼻疽动物模型, 论述了伯克霍尔德菌无法替代类鼻疽菌开展动物试验的理由, 为后续类鼻疽的致病机理研究、诊疗方案探索、药物及疫苗评价提供了实践工具和理论参考。本研究的不足之处在于：（1）类鼻疽动物试验风险高, 研究工作量较大, 因而我们并未应用更多定量工具, 需要更全面地针对不同类鼻疽临床株（以及不同亚种）、不同毒力参数（半数致死量、致死量等）和不同遗传背景小鼠开展研究; （2）本研究着重描述动物实验方法和观察结果, 后续需检测更多临床生化指标, 多手段、全方位地开展动物水平的类鼻疽致病机制研究。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：王佳燕

参考文献
[1] GASSIEP I, ARMSTRONG M, NORTON R. Human melioidosis[J]. Clin Microbiol Rev, 2020, 33(2): e00006-e00019. [本文引用:2]
[2] LIMMATHUROTSAKUL D, GOLDING N, DANCE D A B, et al. Predicted global distribution of Burkholderia pseudomallei and burden of melioidosis[J]. Nat Microbiol, 2016, 1: 15008. [本文引用:2]
[3] CURRIE B J, KAESTLI M. A global picture of melioidosis[J]. Nature, 2016, 529(7586): 290-291. [本文引用:1]
[4] CURRIE B J, MAYO M, WARD L M, et al. The Darwin prospective melioidosis study: a 30-year prospective, observational investigation[J]. Lancet Infect Dis, 2021, 21(12): 1737-1746. [本文引用:1]
[5] FANG Y, CHEN H, LI Y L, et al. Melioidosis in Hainan, China: a restrospective study[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2015, 109(10): 636-642. [本文引用:2]
[6] TAMRAKAR S B, HAAS C N. Dose-response model for Burkholderia pseudomallei (melioidosis)[J]. J Appl Microbiol, 2008, 105(5): 1361-1371. [本文引用:1]
[7] WOODS D E. The use of animal infection models to study the pathogenesis of melioidosis and gland ers[J]. Trends Microbiol, 2002, 10(11): 483-484. [本文引用:1]
[8] MA T F, HU Y, FANG Y, et al. Establishment of a BALB/c mouse model of melioidosis induced by chronic Burkholderia pseudomallei infection[J]. J Third Mil Med Univ, 2017, 39(12): 1239-1244. (in Chinese)
马腾飞, 胡艺, 方瑶, 等. 类鼻疽杆菌慢性感染BALB/c小鼠模型的建立[J]. 第三军医大学学报, 2017, 39(12): 1239-1244. [本文引用:5]
[9] FANG Y, HUANG Y, LI Q, et al. First genome sequence of a Burkholderia pseudomallei Isolate in China, strain BPC006, obtained from a melioidosis patient in Hainan[J]. J Bacteriol, 2012, 194(23): 6604-6605. [本文引用:1]
[10] FANG Y, PAN J, LI Q, et al. Establishment of a Burkholderia pseudomallei invaded RAW264. 7 cell model[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(3): 282-285. (in Chinese)
方瑶, 潘静, 李倩, 等. 类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染RAW264. 7细胞模型的建立[J]. 中国人兽共患病学报, 2013, 29(3): 282-285. [本文引用:2]
[11] KESPICHAYAWATTANA W, RATTANACHETKUL S, WANUN T, et al. Burkholderia pseudomallei induces cell fusion and actin-associated membrane protrusion: a possible mechanism for cell-to-cell spreading[J]. Infect Immun, 2000, 68(9): 5377-5384. [本文引用:1]
[12] STOCKTON J L, TORRES A G. Multinucleated giant cell formation as a portal to chronic bacterial infections[J]. Microorganisms, 2020, 8(11): 1637. [本文引用:1]
[13] MAO X H. Progress on melioidosis[J]. J Third Mil Med Univ, 2011, 33(13): 1315-1317. (in Chinese)
毛旭虎. 加强类鼻疽的研究[J]. 第三军医大学学报, 2011, 33(13): 1315-1317. [本文引用:3]
[14] CHAI L Y A, FISHER D. Earth, wind, rain, and melioidosis[J]. Lancet Planet Health, 2018, 2(8): e329-e330. [本文引用:1]
[15] COSSABOOM C M, MARINOVA-PETKOVA A, STRYSKO J, et al. Melioidosis in a resident of texas with No recent travel history, United States[J]. Emerg Infect Dis, 2020, 26(6): 1295-1299. [本文引用:1]
[16] KONG Z, FANG Y, ZHANG M, et al. Melioidosis acquired by a traveler from Papua New Guinea[J]. Travel Med Infect Dis, 2016, 14(3): 267-270. [本文引用:1]
[17] TITBALL R W, RUSSELL P, CUCCUI J, et al. Burkholderia pseudomallei: animal models of infection[J]. Trans Royal Soc Trop Med Hyg, 2008, 102: S111-S116. [本文引用:1]
[18] VAN SCHAIK E, TOM M, DEVINNEY R, et al. Development of novel animal infection models for the study of acute and chronic Burkholderia pseudomallei pulmonary infections[J]. Microbes Infect, 2008, 10(12/13): 1291-1299. [本文引用:2]
[19] CHEN Y L, YEN Y C, YANG C Y, et al. The concentrations of ambient Burkholderia pseudomallei during typhoon season in endemic area of melioidosis in Taiwan[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2014, 8(5): e2877. [本文引用:1]
[20] YI J, SIMPANYA M F, SETTLES E W, et al. Caprine humoral response to Burkholderia pseudomallei antigens during acute melioidosis from aerosol exposure[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2019, 13(2): e0006851. [本文引用:1]
[21] RUIZ S I, BOWEN L E, BAILEY M M, et al. Pulmonary delivery of ceftazidime for the treatment of melioidosis in a murine model[J]. Mol Pharmaceutics, 2018, 15(3): 1371-1376. [本文引用:1]
[22] FUNNELL S G P, TREE J A, HATCH G J, et al. Dose-dependant acute or subacute disease caused by Burkholderia pseudomallei strain NCTC 13392 in a BALB/c aerosol model of infection[J]. J Appl Microbiol, 2019, 127(4): 1224-1235. [本文引用:1]
[23] LEAKEY A K, ULETT G C, HIRST R G. BALB/c and C57Bl/6 mice infected with virulent Burkholderia pseudomallei provide contrasting animal models for the acute and chronic forms of human melioidosis[J]. Microb Pathog, 1998, 24(5): 269-275. [本文引用:1]
[24] CURRIE B J. Melioidosis: evolving concepts in epidemiology, pathogenesis, and treatment[J]. Semin Respir Crit Care Med, 2015, 36(1): 111-125. [本文引用:1]
[25] MUTTARAK M, PEH W C G, EUATHRONGCHIT J, et al. Spectrum of imaging findings in melioidosis[J]. Br J Radiol, 2009, 82(978): 514-521. [本文引用:1]
[26] SCOTT A E, TWINE S M, FULTON K M, et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailand ensis[J]. J Bacteriol, 2011, 193(14): 3577-3587. [本文引用:2]
[27] KANG Y, NORRIS M H, WILCOX B A, et al. Knockout and pullout recombineering for naturally transformable Burkholderia thailand ensis and Burkholderia pseudomallei[J]. Nat Protoc, 2011, 6(8): 1085-1104. [本文引用:2]
[28] FANG Y, CHEN H, HU Y, et al. Burkholderia pseudomallei-derived miR-3473 enhances NF-κB via targeting TRAF3 and is associated with different inflammatory responses compared to Burkholderia thailand ensis in murine macrophages[J]. BMC Microbiol, 2016, 16(1): 283. [本文引用:1]
[29] KOVACS-SIMON A, HEMSLEY C M, SCOTT A E, et al. Burkholderia thailand ensis strain E555 is a surrogate for the investigation of Burkholderia pseudomallei replication and survival in macrophages[J]. BMC Microbiol, 2019, 19(1): 97. [本文引用:1]
[30] NGAMDEE W, TANDHAVANANT S, WIKRAIPHAT C, et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailand ensis[J]. BMC Microbiol, 2015, 15(1): 1-15. [本文引用:1]