引用本文
刘维俊, 肖方震, 韩腾伟, 王加熊, 周淑姮, 徐国英. 福建省中部地区鼠类钩端螺旋体感染调查[J]. 中国热带医学, 2022,22(1): 42-45.
LIU Wei-jun, XIAO Fang-zhen, HAN Teng-wei, WANG Jia-xiong, ZHOU Shu-heng, XU Guo-ying. Investigation of Leptospira infection in rodents in Central Fujian [J]. China Tropical Medicine, 2022,22(1): 42-45.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.01.09
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福建省中部地区鼠类钩端螺旋体感染调查
刘维俊, 肖方震, 韩腾伟, 王加熊, 周淑姮, 徐国英*
福建省疾病预防控制中心,福建省人兽共患病研究重点实验室,福建 福州 350001
∗通信作者：徐国英,E-mail:doctorfjxgy@126.com

作者简介：刘维俊（1989—）,男,硕士,技师,研究方向：自然疫源性疾病防控。

收稿日期: 2021-07-08
基金资助: 福建省卫生健康科技计划项目资助（No.2019-CXB-13）
摘要

目的 了解福建省中部地区钩端螺旋体主要宿主动物鼠类的种类构成及鼠类钩端螺旋体感染情况,为钩端螺旋体病的防控提供科学依据。方法 2020年6月—2021年5月,在福建省中部地区的闽侯、长乐等五个县（市、区）现场捕鼠,经鼠种鉴定后采集肾脏组织,采用PCR方法进行钩端螺旋体病原检测,同时接种培养基开展病原分离培养,并通过16SrRNA序列对分离到的钩端螺旋体菌株进行基因种鉴定。结果 共捕获鼠类150只,鼠种以黄毛鼠和针毛鼠为主,共135只,占捕获鼠数的90.0%,鼠种相对单一。检出钩端螺旋体感染36只,总感染率为24.0%,其中包括22只黄毛鼠,11只针毛鼠和3只北社鼠。黄毛鼠和针毛鼠的感染率差异无统计学意义（ P>0.05）。闽中地区鼠类钩体感染总体呈现北多南少的情况,其中长乐区鼠类钩体感染率最高（52.9%）,福州地区鼠类钩体感染率（38.6%）显著高于莆田地区鼠类钩体感染率（6.0%）（ P<0.01）。分离培养共获得5株钩端螺旋体菌株,病原分离率为13.9%,包括3株致病性钩端螺旋体和2株非致病性钩端螺旋体。16SrRNA分型显示3株致病性钩端螺旋体分别为2株 Leptospira borgpetersenii型和1株为 Leptospira interrogans型。2株非致病性钩端螺旋体均为 Leptospira jelokensis型。结论 闽中地区鼠类中存在致病性钩端螺旋体感染,应加强钩端螺旋体病的监测和防控。

关键词: 钩端螺旋体; 鼠类; 16S rRNA基因
中图分类号:R377.5 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)01-42-04
Investigation of Leptospira infection in rodents in Central Fujian
LIU Wei-jun, XIAO Fang-zhen, HAN Teng-wei, WANG Jia-xiong, ZHOU Shu-heng, XU Guo-ying
Fujian Provincial Center for Disease Control and Prevention, Fujian Provincial Key Laboratory of Zoonoses, Fuzhou, Fujian 350001, China
Corresponding author: XU Guo-ying, E-mail:doctorfjxgy@126.com
Abstract

Objective To investigate the species composition of the main host animals of Leptospira and the infection of Leptospira in the central part of Fujian Province, so as to provide scientific basis for the prevention and control of leptospirosis in this area.Methods The rodents were captured in Minhou, Changle and the other three cities and counties in Fujian, June 2020-May 2021. After identification of rodent species,the kidney tissues were collected. PCR method was used to detect the pathogen of Leptospira. At the same time, the pathogen was isolated and cultured by medium, and the genotype identification of isolated Leptospira strains was conducted by 16SrRNA sequence.Results A total of 150 rodents were captured in this study, and the main species were Rattus losea and Niviventer fulvescens. The two kinds of rodents accounted for 90.0% (135) of the total number of rodents captured and the rodent species were relatively single. Leptospira infection was detected in 36 rodents, with a total infection rate of 24.0%, including 22 Rattus losea, 11 Niviventer fulvescens and 3 Niviventer confucianus. There was no statistically significant difference in the infection rate between Rattus losea and Niviventer fulvescens ( P>0.05). In central Fujian, the infection rate of Leptospira in the north was higher than that in the south, and the infection rate of Leptospira was the highest in Changle (52.9%). The Leptospira infection rate of rodents in Fuzhou area (38.6%) was significantly higher than that in Putian area (6.0%) ( P<0.01). Five Leptospira strains were isolated and cultured, the pathogen isolation rate was 13.9%, including 3 pathogenic Leptospira and 2 non-pathogenic Leptospira. The genotype identification by 16SrRNA showed that 3 pathogenic Leptospira were 2 Leptospira borgpetersenii and 1 Leptospira interrogans, respectively. Both of the two non-pathogenic strains were Leptospira jelokensis.Conclusions There is pathogenic Leptospira infection in rodents in central Fujian area. The surveillance, prevention and control of Leptospirosis should be strengthened.

Keyword: Leptospira; rodents; 16S rRNA

钩端螺旋体（称“ 钩体” ）是世界尤其是热带亚热带地区最常见的一种人畜共患病的病原体, 严重者可致人体多器官衰竭甚至死亡, 是我国重点防治的传染病之一[1]。受感染的动物宿主通过尿液等排泄物将钩体排出到外界水体中, 且钩体在水体内能长期存在并保持感染性。流行病学调查发现[2], 大多数钩端螺旋体病例存在与被污染水体（或环境）的接触史。福建省中部（闽中）地区适合动植物生长生活[3]。因此, 对闽中地区鼠类钩体感染情况调查有助于了解闽中鼠类钩体病病原携带情况, 对钩体病人间疫情的风险评估有积极的意义。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 主要试剂 病原分离EMJH培养基购自美国BD公司, 鼠肾核酸提取采用QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit试剂盒, 钩体菌株核酸提取采用QIAampDNAMini Kit试剂盒（购自QIAGEN公司）, 钩体PCR所用Premix Taq购自TaKaRa公司, 钩体筛查引物序列参考《钩端螺旋体诊断标准》[4], 基因种鉴定引物序列参考文献[5], 见表1, 实验所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 钩体筛查及基因种鉴定引物序列 Table 1 The primers of Leptospira detection and gene species identification of Leptospira

1.1.2 鼠类捕获 2020年6月— 2021年5月, 在福州市南部部分县市及莆田市全境, 选择山地、沿海地区农田、河岸芦苇丛等生境, 采用笼日法进行捕鼠, 采用形态学和DNA条形码方法鉴定鼠种[6], 记录捕获鼠的性别、年龄、捕获生境等信息, 用氯仿麻醉, 在无菌环境下解剖, 采集肾脏标本于-80 ℃冰箱中备测[7]。

1.2 方法

1.2.1 钩体筛查 参照QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit步骤完成鼠类肾标本核酸提取, 所得核酸可直接作为PCR反应模板。PCR反应采用20 μ L体系, 扩增条件为：95 ℃预变性5 min, 94 ℃ 1 min, 55 ℃1 min, 72 ℃ 1.5 min, 设35个循环, 72 ℃延伸10 min, 所得PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后, 在凝胶成像系统中观察产物条带。

1.2.2 钩体培养分离 对筛查结果阳性的鼠类肾标本进行病原培养分离, 具体操作如下：无菌条件下, 取米粒大小的鼠类双侧肾标本, 接种于含250 μ g 5-氟脲嘧啶/mL的EMJH培养基中。将培养管置于28 ℃恒温培养箱中培养, 每隔5~7 d, 取适量培养物置于干净玻片上, 于暗视野显微镜下观察。若有钩体生长, 则取0.5 mL接种于新鲜培养基; 若未见钩体生长, 则继续培养60 d, 仍未见生长者则判为阴性[8]。

1.2.3 钩体基因种鉴定 分离培养所得的钩体菌株参照QIAampDNAMini Kit步骤完成核酸提取, 作为PCR反应模板。以16S rRNA片段作为钩体基因种鉴定的目的片段, PCR反应采用50 μ L体系, 扩增条件为：94 ℃预变性5 min, 94 ℃ 15 s, 50 ℃ 5 s, 72 ℃ 90 s, 设35个循环, 72 ℃延伸5min。所得PCR产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳后, 在凝胶成像系统中观察产物条带, 产物条带明亮清晰者转送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析 测序所得序列在美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上进行同源性比较。在数据库中选取合适的序列作为参考, 系统进化树的构建采用Mega6.0软件（NJ法）完成。

1.3 统计学分析

采用SPSS25.0软件进行统计学处理, 感染率比较采用χ 2检验。检验水准为α =0.05。

2 结果
2.1 不同县市鼠类肾标本PCR钩体筛查

共捕获鼠类150只, 全部解剖取肾标本提取核酸, 经PCR钩体筛查, 36只鼠钩体感染, 钩体感染为24.0%。福州市闽侯区、长乐区、福清区和莆田市仙游区、荔城区鼠类钩体感染率分别为41.0%（16/39）、52.9%（9/17）、25.9%（7/27）、13.8%（4/29）, 0.0%（0/38）, 五区以长乐区鼠类钩体感染率最高, 差异有统计学意义（χ 2=27.716, P< 0.01）。福州市鼠类钩体感染率为38.6%（32/83）, 高于莆田市的6.0%（4/67）（χ 2=21.580, P< 0.01）。

2.2 鼠种构成及钩体感染情况

本次调查显示闽中地区野外环境中鼠种构成主要以黄毛鼠、针毛鼠为主, 占捕获总数的90.0%。主要鼠种黄毛鼠与针毛鼠在钩体感染率上的差异无统计学意义（χ 2=0.367, P> 0.05）, 见表2。

表2 不同鼠种钩体感染情况 Table 2 Leptospirainfection in different rodents species
2.3 钩体分离培养

从36只检出钩端螺旋体感染的标本中共分离培养5株钩体菌株, 分离率为13.9%。

2.4 钩体基因种鉴定

测序所得序列分别在NCBI网站上进行序列比对。采集长乐的CL16和采集闽侯的MH20与登录号为MN062728.1的Leptospira jelokensis相似性最高, 分别为99.93%和99.79%, 采集闽侯的MH28与采集福清的FQ22与登录号为 CP012029.1的Leptospira borgpetersenii相似性最高, 分别为100.00%和99.86%。采集福清的FQ12则与登录号为CP044513.1的Leptospira interrogans相似性最高, 为99.93%。基于16S rRNA构建的系统进化树(图1)显示, FQ12的基因种鉴定为Leptospira interrogans型, FQ22、MH28的基因种鉴定为Leptospira borgpetersenii型, 此3份标本均归属于致病性钩端螺旋体的分支内。CL16和MH20的基因种鉴定为Leptospira jelokensis型, 与Leptospira biflexa型、Leptospira meyeri型均归属于非致病性钩端螺旋体分支内。

图1 基于钩端螺旋体16S rRNA构建的系统进化树（NJ法）Fig. 1 Phylogenetic tree based on Leptospira 16S rRNA（NJ method）

3 讨论

福建省曾是我国钩体病重点流行地区之一, 病例分布广泛, 由于积极的防控, 从1992年至今人间钩体疫情相对平稳, 但仍有个别地区呈现局部流行态势, 鼠类血清抗体的阳性率亦处于不低的水平, 因此对钩体病的监测和防控十分必要[9]。鼠类作为钩体的储存宿主, 在钩体生长以及传播方面起着重要的作用。本次采用聚合酶链式反应（PCR）的方法对闽中地区鼠类钩体感染率进行调查, 调查结果表明除莆田荔城区外, 各调查点均发现感染钩体的鼠类, 且闽中地区鼠类钩体感染总体呈现北多南少的情况。福州地区（闽侯、长乐、福清）鼠类钩体感染率显著高于莆田地区（仙游、荔城区）, 这与闽中地区人间钩体的流行情况一致, 建议当地可通过开展灭鼠工作, 降低人群钩体感染率[10]。闽中地区鼠类种类相对单一, 黄毛鼠和针毛鼠占了本次调查捕获鼠的90%, 提示该地区应当注意加强对黄毛鼠、针毛鼠种群数量的监测工作。

以16S rRNA片段对钩体菌株进行基因种的鉴定是一种快速简便的分型方法, 已在国内外多个国家和省份有过报道[11, 12, 13]。对钩体的准确分型有助于追踪传染源、确定宿主媒介, 同时有助于流行病学溯源的研究, 以便于及时控制疫情[14, 15]。本次调查分离培养所得的5株钩体菌株, 经基因种鉴定发现, 闽中地区的鼠类同时携带有致病性和非致病性钩端螺旋体, 并且致病性钩端螺旋体Leptospira interrogans与邻近省份江西的流行株序列相似度高, 表明Leptospira interrogans型可能是中国东南部地区钩体流行型别之一, 邻近省份间的病例可能存在流行病学关联。本次闽中地区鼠类钩端螺旋体感染情况调查为闽中地区鼠间钩体病的分子流行病学研究提供了基础资料, 后续应继续加强对当地鼠密度、鼠种构成及鼠间钩体病的监测, 才能有效地预防和控制人间疫情的发生。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：符式刚

参考文献
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