Notomi等^[10]于2000年发明的LAMP技术目前已经逐步发展成熟和完善并且已经在多个领域展开了广泛的应用。LAMP的扩增过程较复杂, 依赖靶基因上的六个区域以及由此设计的两组特异性引物完成。其原理为, 链置换型DNA聚合酶在55~65 ℃的温度条件下启动一组引物的反应合成DNA, 然后另一组引物进行链置换形成单链, 被释放出的单链存在互补片段产生大量茎环结构。以此单链DNA作为模板在DNA聚合酶作用下, 启动另一端的复制, 以此方法产生的DNA双链可形成哑铃结构。哑铃结构以自身作为模板, 同时在3'端与同侧的互补片段区域同时启动复制, 形成新的茎环结构与被置换的互补链, 如此往复产生大量长短不一的DNA片段。LAMP技术扩增的产物可以直接通过肉眼观察, 反应过程中形成的大量焦磷酸根离子聚集成白色沉淀, 可以此判断是否有产物出现^[11]。除此之外还可通过实时荧光信号、琼脂糖凝胶电泳等方法对LAMP的产物进行检测^{[12, 13]}。该技术实现了恒温扩增, 但温度条件的要求仍然远高于室温, 且引物设计过程较为复杂。尽管如此, LAMP技术作为一项发展较为成熟的等温扩增手段具有成本低、敏感性强、特异性高、稳定性高等优势, 随着LAMP的不断发展, 这类检测技术在病原检测工作中发挥更大的作用^{[13, 14]}。

在各类疟原虫的实验室诊断中LAMP技术以其较强的稳定性和适用性展现出了传统分子生物学检测不具备的优势。与PCR技术相比, LAMP可以在不开管的情况下通过在紫外光下肉眼观察或直接观察是否产生沉淀对产物进行判断。在一项针对疟疾的临床样本检测中, 根据疟原虫属线粒体基因以及卵形疟原虫、间日疟原虫的18S核糖体基因设计的LAMP检测方法最低可分别检测至100、100、1 000个拷贝数的含目的片段阳性质粒。在临床样本试验中, 该技术与巢式PCR技术在检测灵敏度与特异度方面展现出较高的一致性, 且均优于吉姆萨染色后镜检^[15]。此外, 在哥伦比亚孕妇的胎盘血与外周血的疟疾筛查项目中^[16], 分别比较了光学显微镜检测、快速诊断试剂盒与LAMP三种方法对疑似疟疾患者血液样本的检测能力, 在灵敏度与特异度方面LAMP均优于另外两类方法。一系列研究表明LAMP技术在疟疾的实验室诊断中能够达到巢式PCR的检测水平且优于传统的病原学检测和商业化的试剂盒, 同时不需要巢式PCR长达数小时的反应时间与复杂的仪器。因此, 该技术对于疟疾的诊断有极高的价值。近年来, LAMP技术不断与其他技术结合, 大大提高了该方法的实用性。如利用金纳米粒子的热聚集性结合LAMP开发的一项针对恶性疟原虫的检测技术可以通过生成亲和素-生物素复合物簇实现信号放大, 在恶性疟原虫检测中以其简便的可视化手段避免了扩增子污染问题, 为恶性疟的诊断提供了一种全新的手段^[17]。

巴贝虫感染者受自身免疫功能影响通常不出现明显症状, 错过及时治疗的感染者体内巴贝虫不能被机体完全清除并在血液中保持较低的虫密度^[18]。因此, 对于血液中低虫密度的带虫者, 高度敏感的实验室诊断技术尤为重要。LAMP技术自建立以来便展现了极高的检测敏感性。吴芬等^[19]根据田鼠巴贝虫细胞色素B基因保守序列设计了多套引物并建立了LAMP检测方法。该方法检出限量为0.687 fg/μ L, 而PCR的最低检测量为0.687 pg/μ L, 且在该试验中与疟原虫等其他主要对人类致病的原虫无交叉反应。

2006年由Twist生物技术公司开发的RPA技术自面世以来逐步在医疗、农业、食品安全等领域展开了应用^{[20, 21, 22]}。RPA扩增的靶序列长度选择为200~400 bp, 通常在37~42 ℃的温度条件下进行反应, 20~30 min即可完成核酸的扩增以达到可检测水平^{[23, 24]}。反应体系包括：T4噬菌体编码的重组酶蛋白、单链结合蛋白（gp32蛋白）和DNA聚合酶。其原理为重组酶与引物结合并双向扫描靶序列, 在特异性结合位点打开DNA双螺旋结构开始在DNA聚合酶作用下完成复制, 单链结合蛋白与一条单链结合防止发生进一步替换。目前, RPA产物的检测手段主要包括：测流层析试纸条检测法、琼脂糖凝胶电泳法、实时荧光定量检测法等^{[25, 26]}。虽然RPA还存在易受气溶胶污染、特异性相对较差、成本高等问题, 但是此类扩增技术是目前最贴近实际温度条件下的等温扩增技术, 能在保证高敏感性的情况下有效实现病原体的现场快速检测。目前, 为避免琼脂糖凝胶电泳的RPA产物检测中出现气溶胶污染, 结合荧光信号的实时检测与结合测流层析试纸条检测的相关研究开展更为普遍。

与实时荧光定量技术相结合的RPA曾应用于一项诺氏疟原虫的检测中, 对于最低1个拷贝数的阳性质粒可通过荧光信号完成检测^[27]。然而, 实时荧光定量技术依赖昂贵的仪器, 在设备简单的实验室无法完成此检测。Lalremruata等^[28]分别在疟疾疫苗接种人群与无症状人群中验证了其开发的等温逆转录重组酶聚合酶扩增测流层析检测法。在低虫密度感染的68例疟疾疫苗接种志愿者中, 以逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应检测结果作为参照, RT-RPA检测结果灵敏度为88％, 特异度可达到100％。此外, Lalremruata等^[28]为简化步骤, 使该方法更适用于现场条件, 设计了一类能够直接检测待测人群血样的RPA试纸条, 可不经核酸提取直接对疑似疟疾患者进行检测。在28例无症状者的筛查中, 灵敏度可达到88％, 特异度为90％。目前, RPA推出了商业化的试剂盒, 酶以冻干粉形式保存, 效果更加稳定, 这也进一步促进了RPA技术在疟疾诊断中的应用^[29]。

在畜牧业领域, 关于动物易感的吉氏巴贝虫、牛巴贝虫等检测研究不断开展。在这类研究基础上, Nie等^[30]开发了针对田鼠巴贝虫线粒体基因的RPA测流层析检测方法。与常规的PCR技术相比, 该方法的敏感性提高了40倍且在与吉氏巴贝虫、东方巴贝虫等同属寄生虫检测中未出现交叉反应。针对临床样本与实验动物样本的评估中RPA也展现了优于PCR的灵敏性。15~30 min的反应时间与更贴近环境温度的反应条件使RPA成为巴贝虫现场检测的新的适宜技术。

2011年开发的RAA技术与RPA技术在原理和反应条件等方面类似^[31], 区别在于反应过程中重组酶的来源。RPA扩增中重组酶来源于T4噬菌体, 而RAA扩增采用的是某些细菌或真菌中提取出的重组酶^[32]。与RPA技术相比, RAA能够在保证反应敏感性与特异性的同时降低检测工作中所需的成本。RAA的扩增产物同样主要使用琼脂糖凝胶电泳法、实时荧光定量法、测流层析试纸条法进行检测。作为一类最新型的等温扩增技术, RAA的反应体系还存在稳定性相对较差的问题, 但随着相关应用的逐步开展, 该方法以其较低的成本在现场检测工作的应用中展现出了良好的适用性。

郑伟等^[33]建立了一项针对疟原虫的RAA实时荧光检测, 最低可对100个拷贝的阳性质粒进行扩增。目前, 该技术在棘球绦虫、日本血吸虫、利什曼原虫的检测中均展开了相关研究, 这为RAA在疟原虫与巴贝虫检测领域相关研究的进一步开展提供了丰富的理论依据与技术支持。

HDA是美国NEB公司在2004年发明的等温扩增技术, 其原理相对简单, 是仿照活体细胞内的核酸复制方式进行^[34]。反应体系主要包括DNA解旋酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、正反向引物与模板。反应过程为：在DNA解旋酶作用下, 模板打开双链, 再由单链结合蛋白结合打开的双链使其保持稳定, 最后在DNA聚合酶作用下进行引物的延伸, 完成复制过程。根据解旋酶的不同, 可以将其分为常温HDA、耐热HDA、环状HDA等^[35]。HDA技术可以结合琼脂糖凝胶电泳与实时荧光技术等对扩增产物进行检测。其优点是该技术扩增效率高、引物设计简单、对于样本要求较低。但HDA也存在一系列问题, 包括对扩增靶序列的长度要求较为严格、酶成本高等。目前, 随着HDA相关技术的完善与进步, 该技术已经逐步在环境监测、临床检查等领域展开应用。

在一项针对疑似疟疾患者血液样本的筛查实验中, Li等^[36]开发了一类依赖嗜热解旋酶等温扩增技术, 将88份未经核酸提取的可能患有巴贝虫病或疟疾的患者血液样本直接通过疟原虫属引物进行扩增, 扩增产物与探针结合实现可视化检测。此批样本以吉姆萨染色后涂片镜检与核酸序列依赖性扩增技术检测结果作为金标准。样本的HDA检测结果显示其灵敏度与特异度均达到较高的水平。该实验过程中省略了核酸提取步骤, 仅需2 μ L人血液样本即可完成检测, 除水浴锅外不需要其他设备。其简便的操作过程与对仪器设备的低依赖性适用于现场条件下的疟疾诊断工作。同时, 也为其他血液原虫的现场快速检测提供了可行的方案。