引用本文
强钰, 余永娟, 任广旭, 李佳琦, 赖秀仪, 王媛, 雷胜, 张云, 李婷婷, 周云飞, 吕刚. 海南省白沙黎族自治县中小学生芽囊原虫分子遗传特征分析[J]. 中国热带医学, 2022,22(10): 909-912.
QIANG Yu, YU Yong-juan, REN Guang-xu, LI Jia-qi, LAI Xiu-yi, WANG Yuan, LEI Sheng, ZHANG Yun, LI Ting-ting, ZHOU Yun-fei, LYU Gang. Molecular genetic characterization of Blastocystis in primary and middle school students in Baisha Li Autonomous County, Hainan [J]. China Tropical Medicine, 2022,22(10): 909-912.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.10.04
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海南省白沙黎族自治县中小学生芽囊原虫分子遗传特征分析
强钰1,2, 余永娟3, 任广旭1,2, 李佳琦1,2, 赖秀仪1,2, 王媛1,2, 雷胜1,2, 张云1,2, 李婷婷1,2,4, 周云飞1,2,4, 吕刚1,2,*
1.海南医学院热带病转化医学重点实验室,海南 海口 571199
2.海南医学院-香港大学热带传染病联合实验室,海南 海口 571199
3.白沙黎族自治县人民医院检验科,海南 白沙 572800
4.海南医学院基础医学与生命科学学院病原生物学教研室,海南 海口 571199
*通信作者：吕刚,E-mail: ganglu2018@163.com

作者简介：强钰（1991—）,女,硕士,初级检验师,研究方向：热带医学。

收稿日期: 2022-06-06
基金资助: 国家自然科学基金项目（No. 82060375）; 海南省自然科学基金高层次人才项目（No. 822RC695）; 海南省院士创新平台项目（No. YSPTZX202004）; 海南省高等学校科学研究项目（No. Hnky2021-44）
摘要

目的 为了解海南省白沙黎族自治县中小学生芽囊原虫感染情况及其亚型分布特征,对该地两所中小学的学生进行了调查研究。方法 2021年3—11月,收集海南白沙黎族自治县两所中小学学生的粪便样本。采用PCR方法扩增芽囊原虫核糖体小亚基基因（small subunit ribosomal RNA gene, SSU rDNA）,通过序列分析确定芽囊原虫的感染情况和亚型,使用Mega 7软件构建系统发育进化树。同时对不同年级、性别的中小学生芽囊原虫的感染情况进行分析,评估感染相关因素。结果 海南省白沙黎族自治县中小学生芽囊原虫感染率为4.1%（13/314）,不同年级和性别的中小学生感染率差异无统计学意义（P>0.05）。经序列分析,共鉴定出3种芽囊原虫亚型,分别是ST3（n=7）、ST7（n=4）和ST1（n=2）,这些亚型均具有人兽共患特性。结论 本研究首次从分子水平对海南地区人群进行芽囊原虫研究,为该地区芽囊原虫病的防控提供了基础数据。多个人兽共患亚型的检出,提示未来需要进一步对该区域的人和动物进行芽囊原虫感染情况进行研究,以探究芽囊原虫可能感染的来源,为该地区芽囊原虫的防控提供科学依据。

关键词: 芽囊原虫; 感染; 中小学生; 海南
中图分类号:R382 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)10-909-05
Molecular genetic characterization of Blastocystis in primary and middle school students in Baisha Li Autonomous County, Hainan
QIANG Yu1,2, YU Yong-juan3, REN Guang-xu1,2, LI Jia-qi1,2, LAI Xiu-yi1,2, WANG Yuan1,2, LEI Sheng1,2, ZHANG Yun1,2, LI Ting-ting1,2,4, ZHOU Yun-fei1,2,4, LYU Gang1,2,4
1. Key Laboratory of Translation Medicine Tropical Diseases, Hainan Medical University, Haikou, Hainan 571199, China
2. Hainan Medical University - The University of Hong Kong Joint Laboratory of Tropical Infectious Diseases, Hainan Medical University, Haikou, Hainan 571199, China
3. Department of Clinical Laboratory, Baisha Li Autonomous County People's Hospital, Baisha, Hainan 572800, China
4. Department of Pathogen Biology, College of Basic Medicine and Life Sciences, Hainan Medical University, Haikou, Hainan 571199, China
Corresponding author: LYU Gang, E-mail: ganglu2018@163.com
Abstract

Objective To investigate the prevalence and genetic characterization of Blastocystis in primary and middle school students in Baisha Li Autonomous County, Hainan Province, in order to understand the infection status of Blastocystis and its subtype distribution characteristics in this area.Methods From March to November 2021, fecal samples were collected from two primary and middle schools in Baisha Li Autonomous County. Nested PCR targeting the SSU rDNA was employed in this study, sequence analysis were performed to determine the prevalence and subtype. A neighbor-joining tree was built using Mega 7. Meanwhile, the risk factors of the Blastocystis infection among different grades and genders were evaluated.Results The infection rate of Blastocystis was 4.1% (13/314), there was no statistical difference in infection rates among genders and grades ( P>0.05). Sequence analysis revealed that three Blastocystis subtypes were identified, namely ST3 ( n=7), ST7 ( n=4) and ST1 ( n=2), all of which have zoonotic potential.Conclusions This is the first report of the identification of Blastocystis in humans in Hainan at the subtype level, and provide the basic data for the prevention and control of Blastocystis in this area. The zoonotic subtypes identified in this area indicated more studies should be taken in humans and various animals, to better evaluate the transmission of Blastocystis and provide scientific support for the prevention and control of Blastocystis.

Keyword: Blastocystis; infection; primary and middle school students; Hainan

芽囊原虫（Blastocystis）是一种常见的机会性致病的单细胞肠道原虫, 该病原体呈世界性分布, 在热带地区和亚热带地区尤为多见[1]。芽囊原虫可通过粪-口途径在人和动物间传播, 人类被感染后可出现腹痛、腹泻等肠道症状及皮肤症状[1]。基于SSU rDNA序列分析, 可将芽囊原虫分为28个ST亚型[2]。这些ST亚型的宿主范围、地理分布及致病力存在差异, 13个亚型（ST1~ST10、ST12、ST14及ST16）为人兽共患亚型, 而其他亚型仅在动物体内发现。95%的人体芽囊原虫病例是由ST1~ST4引起[1]。

白沙黎族自治县位于海南中部山区, 历史上是各种热带病包括肠道寄生虫病的高发区, 该地区人群芽囊原虫感染情况尚不明确。我国自1990年首次在广西两例慢性腹泻儿童体内检测到芽囊原虫以来, 超过12个省/自治区报道了芽囊原虫人体病例[3], 中小学及高校学生芽囊原虫感染率为1.1%~16.6%[1]。1996年江西省曾发生由饮用水导致的芽囊原虫暴发事件, 导致千余人出现腹泻、腹痛、发热等症状, 且43.2%的患者为15岁以下的中小学生和儿童[4]。为了解白沙黎族自治县中小学生芽囊原虫感染情况及其亚型分布特征, 本研究对该地两所中小学的学生进行了调查研究。

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 研究对象 以海南白沙黎族自治县两所中小学的学生为研究对象, 纳入标准为：①3个月内未服用抗寄生虫类药物; ②自愿参加调查并通过监护人同意。

1.1.2 仪器和试剂 PCR仪（德国Eppendorf 公司）、电泳仪（美国 BIO-RAD 公司）、紫外凝胶成像系统（上海天能公司）。QIAamp DNA Mini Stool Kit提取试剂盒（德国QIAGEN公司）、Taq DNA 聚合酶（日本Takara公司）、10×PCR Buffer（日本Takara公司）、dNTP（日本Takara公司）、琼脂糖（西班牙Biowest公司）、GelRed染液（美国Biotium公司）、引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样本的采集与处理 2021年3—11月, 使用无菌粪便杯收集被调查人员新鲜粪便样本3~5 g。记录受调查者的就学年级、性别、民族等基本信息。样本采集后放置于4 ℃冰箱中暂存, 并于12 h内运送至实验室。样本分装后保存在-80 ℃冰箱直至检测。

1.2.2 DNA提取 按照QIAamp DNA Mini Stool Kit提取试剂盒（德国QIAGEN公司）说明书提取粪便样本基因组DNA。DNA的提取方法具体步骤为：（1）在装有约200 mg粪便的2 mL组织破碎管中加入1.0 mL的Inhibit EX® Buffer, 在组织破碎仪中以4 000 r/min持续30 s, 反复3次。（2）将破碎后的粪便样本转移至2.0 mL的EP管中, 并涡旋15 s。（3）将混匀后的粪便样本置于95 ℃的金属浴中加热5 min。（4）涡旋震荡 15 s, 全速离心（14 000 r/min, 离心半径8.4 cm）1 min。（5）吸取15 μ L蛋白酶K置于1.5 mL EP管中。（6）吸取200 μ L上清加入到上一步EP管中, 再加入200 μ L的AL缓冲液, 涡旋震荡15 s。（7）将混合好的液体样本置于70 ℃的金属浴中加热10 min。（8）将加热后的液体样本取出, 加入200 μ L的无水乙醇, 涡旋震荡混匀。（9）将第8步骤中的裂解液加入到过滤柱中, 且将过滤柱放入到一个新的2.0 mL的EP管中, 在过滤柱盖子上进行标记, 全速离心（14 000 r/min, 离心半径8.4 cm） 1 min。（10）取出离心后的过滤柱, 将过滤柱转移至一个新的EP管中, 加入500 μ L的AW1缓冲液, 全速离心（14 000 r/min, 离心半径8.4 cm）1 min。（11）再次取出离心后的过滤柱, 并将其转移至一个新的 EP管中, 加入500 μ L 的AW2缓冲液, 全速离心（14 000 r/min, 离心半径8.4 cm）3 min。（12）将离心后的过滤柱再次转移至一个新的2.0 mL的EP管中, 全速离心（14 000 r/min, 离心半径8.4 cm）3 min。（13）最后取出过滤柱, 将其转移至新的1.5 mL EP管中, 直接加入200 μ L的ATE缓冲液, 室温孵育1 min, 全速离心（14 000 r/min, 离心半径8.4 cm）2 min, 洗脱DNA。提取后的DNA放置于 -20 ° C冰箱保存, 用于PCR分析。

1.2.3 PCR扩增及电泳检测 参照Santí n等[5]所设计的引物、反应条件及反应体系扩增芽囊原虫SSUrDNA基因。PCR反应体系为25 μ L：DNA模板2 μ L, 10×PCR Buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L, 上游引物RD1（GGAGGTAGTGACAATAAATC）0.5 μ L, 下游引物RD2（TGCTTTCGCACTTGTTCATC）0.5 μ L, Taq DNA聚合酶0.5 μ L。反应条件为：95℃ 4 min; 95 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 35个循环; 72 ℃ 5 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 阳性产物送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析及系统发育分析 将测序校对后的序列与GenBank数据库中的基因序列比对, 确定芽囊原虫ST亚型。使用Mega7中Neighbor-Joining（NJ）法构建系统发育进化树, 基于Kimura two-parameter 模型计算遗传距离; 并通过1 000 次 bootstrap重复验证其的可靠性。

1.3 统计学分析

用SPSS统计软件对性别、年级分组信息进行统计分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 研究对象信息

剔除无效样本后, 共计314人接受调查。其中黎族学生283人, 汉族学生27人, 苗族学生3人, 侗族学生1人。男性152人, 女性162人。中学生158人, 小学生156人。所有学生均无腹泻症状。

2.2 芽囊原虫感染情况

本次调查共采集中小学生314人, 其中13份样本检测阳性, 感染率为4.1%。年级阶段（χ2=2.07, P=0.168）和性别（χ2=0.03, P=0.868）的中小学生感染率差异无统计学意义。见表1。

表1 芽囊原虫的年级和性别分布情况 Table 1 Grade and gender distribution of Blastocystis infection
2.3 芽囊原虫亚型及系统发育分析

将测序成功的样本进行序列分析, ST3中4份样本的SSU rDNA序列与参考序列MT330266（ST3）同源性为100%, 3份样本与KX108732（ST3）同源性为100%。ST7中2份样本与MW538388（ST7）同源性为100%, 1份样本与KX234607（ST7）同源性为100%, 1份样本（GenBank号：OM865864）与MN472808（ST7）同源性为99.13%。ST1中1份样本与MK587498（ST1）同源性为100%, 1份样本（GenBank号：OM865859）与KU147334（ST1）同源性为99.58%。本研究获得的芽囊原虫分离株的系统发育分析结果如图1所示。

图1 芽囊原虫分离株基于SSU rDNA的系统发育树
本研究获得的已知亚型和新亚型分别用“ ■” 和“ ●” 标注。Fig. 1 Phylogenetic tree based on SSU rDNA of Blastocystis isolates
The‘ ■’ and‘ ●’ indicate known and novel subtypes obtained in this study, respectively.

本研究中共鉴定出3种芽囊原虫ST亚型, 分别是ST3（n=7）、ST7（n=4）和ST1（n=2）, 其中优势亚型为ST3（53.8%, 7/13）。小学生感染的亚型为ST3（n=5）和ST7（n=4）, 而中学生感染的亚型为ST1（n=2）和ST3（n=2）。女生感染的亚型为ST3（n=3）、ST1（n=2）和ST7（n=2）, 男生感染的亚型为ST3（n=4）和ST7（n=2）。见表1。

3 讨论

芽囊原虫是一种常见的机会性致病肠道原虫, 据估计全世界超过10亿人感染芽囊原虫[6]。目前, 除南极洲之外的各大洲均有芽囊原虫流行的相关报道, 人芽囊原虫感染率为1.3%~70.0%[7]。据报道, 我国芽囊原虫感染率为0.007%~48.6%, 农村地区芽囊原虫感染率高于城市地区, 南方地区芽囊原虫感染率高于北方地区[1]。

本研究对来自海南白沙黎族自治县的314名中小学生芽囊原虫的感染情况进行了调查, 感染率为4.1%（13/314）, 显著高于海南省普通人群的感染率0.6%（16/1 298）[8], 以及海口市郊区小学生的感染率0.37%（2/315）[9], 但低于重庆市江津区小学生的感染率15.2%（71/466）[10], 以及新疆2~6岁儿童的感染率14.3%（87/609）[11]。不同地区芽囊原虫感染率可能与检测方法、地理环境、生活习惯、经济水平、卫生条件有关。本研究中, 小学生芽囊原虫感染率高于中学生, 这可能与儿童免疫力逐步发育完全及卫生习惯的养成有关, 这与Gong等[12]发现中缅边境的少数民族中7~12岁的儿童感染率高于13~17岁少年及>18岁的成年人的结果相似, 提示应加强对小学生及学生家长的卫生宣传教育。

本研究检测到3个芽囊原虫亚型ST3（n=7）、ST7（n=4）及ST1（n=2）, 对芽囊原虫分离株的系统发育分析结果与同源性分析结果相同, 各分离株分别汇聚在ST1、ST3和ST7亚型分支上。我国人群已报道的芽囊原虫感染亚型包括ST1~ST7和ST12, 另外还有一些未知亚型的报道[1]。不同亚型在我国人群中的地理分布不同, 例如, 云南、黑龙江、新疆、浙江和上海ST3为优势亚型, 广西的优势亚型为ST1, 重庆的优势亚型为ST6, 而河北的优势亚型为ST2[1]。这些研究表明, 芽囊原虫亚型分布可能与各亚型的宿主范围、传播模式有关。本研究芽囊原虫优势亚型为ST3, 在我国, 黑龙江肿瘤患者[13]和云南瑶族[14]感染芽囊原虫的优势亚型也是ST3。此外, ST3也在我国猪、牛、羊、狗、猴等多种动物体内分离得到[1, 15, 16]。本研究中ST7的感染率仅次于ST3, 该亚型最初被发现在新加坡有肠道症状的患者体内[17], 并且在新加坡艰难梭菌感染者中呈现出优势性[18]。此后多个国家和地区报道了ST7感染人体病例, 在我国, ST7在南昌HIV/AIDS患者[19]、云南HIV患者[14]以及重庆中小学生[10]和住院患者[20]中检出。ST7除了感染人外, 主要感染鸟类[6]。在白沙黎族自治县中小学生检出ST7的比例较高（30.8%）, 提示进一步检测该地区禽类芽囊原虫感染情况, 探索中小学生感染芽囊原虫ST7可能的感染途径。本研究在两名中学生的粪便样本中检出ST1, 该亚型曾在在我国黑龙江肿瘤患者[13]、新疆儿童体内[11]报道。此外, ST1也在我国猪、羊、骆驼、熊、狗、猴体内分离得到[1, 21]。

本研究首次在亚型水平对海南地区人群进行芽囊原虫研究, 为该地区芽囊原虫病的防控提供了基础数据。芽囊原虫人兽共患亚型ST3、ST7和ST1的检出, 提示未来需要进一步对该区域的动物进行芽囊原虫感染情况进行研究。此外, 还应扩大调查的人群, 深入探究芽囊原虫感染的相关因素（如水源、食物来源、动物接触史、厕所类型、洗手习惯等信息）, 以探究芽囊原虫可能感染的来源, 为该地区芽囊原虫的防控提供科学依据。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：王佳燕

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