1.1.1 实验动物 本实验所用4周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠的饲育、维持、以及实验处理均在首都医科大学SPF级动物实验设施中进行。

1.1.2 病毒 研究所用JEV病毒为Beijing-1株, 由本实验室保存。

1.1.3 药物及其他试剂 苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate), 分子式C26H33FN407, 购自阿拉丁公司（货号：341031-54-7）; RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）、青-链霉素购自Gibco公司; HE染色试剂购自索莱宝公司（货号G110）; 兔源CD4抗体购自Abcam公司（货号ab183685）, 兔源CD8a抗体购自Abcam公司（货号ab199016）; 鼠源4G2抗体由本实验室制备保存; 山羊抗鼠Alexa Fluor® 488抗体购自Invirogen公司（货号A11055）; 探针法Quant一步法反转录-荧光定量试剂盒购自TIANGEN公司（货号FP304); TansZol试剂盒购自TransGen公司（货号ET101); 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体购自中山金桥公司（货号PV-9001）。

1.2.1 实验组设置 药物处理天数优化：实验动物选用4周龄BALB/c小鼠, 雌雄各半, 随机分为3组, 每组10只。实验组分为前5 d给药组（sunitinib 5 d组）和10 d给药组（sunitinib 10 d 组）, 于腹腔注射舒尼替尼 0.015 mg, 1次/1 d , 分别连续给药5 d和10 d。对照组（PBS组）腹腔注射同等剂量的PBS溶液, 1次/1 d, 共 5 d。在给与舒尼替尼后第2天, 实验组和对照组均腹腔注射10⁶PFU JEV。小鼠病毒感染及药物处理实验设置对照组（PBS组）和前5 d给药组（sunitinib 5 d组）。

1.2.2 细胞培养及病毒增殖 C6/36细胞（白纹伊蚊幼虫细胞）由本实验室保存, 基础培养基为RPMI1640培养基, 常规培养用含10% 胎牛血清和1% 青-链霉素双抗的RPMI1640培养基; 增殖病毒用含2% FBS和1% PS的RPMI1640培养基。置于28 ℃、含5% CO₂的恒温培养箱中培养。Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）由本实验室保存, 基础培养基为MEM培养基, 常规培养用含5% FBS和1% PS的MEM培养基; 病毒感染用含2% FBS和1% PS的MEM培养基。置于37 ℃、含5% CO₂的恒温培养箱中培养。JEV的增殖在C6/36细胞上进行, 增殖后的JEV病毒放于-80 ° C冻存。

1.2.3 小鼠脑内病毒载量检测 采用TansZol试剂盒提取脑组织中的总RNA。采用探针法Quant一步法反转录-荧光定量试剂盒检测脑组织中病毒RNA的绝对定量; 探针序列为：5'-FAM-CCACGCCACTCGACCCATAGACTG-TAMRA-3'; 正向引物（JENS3F)：5'-AGAGCACCAAGGG AATGAAATAGT-3'; 反向引物（JENSR)：5'-AATA GGTTGTAGTTGG GCACTCTG-3', 按照试剂说明配置20 μ L反应体系, 在ABI7500平台上完成qRT-PCR, 以病毒拷贝数的对数作为y轴, Ct值作为x轴, 绘制标准曲线, 导出回归方程。将每个样本的Ct值代入方程得到脑组织中病毒载量, 表示为JEV拷贝数/μ g总RNA。

1.2.4 小鼠脑组织切片HE染色 组织标本经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋, 制成厚度为4 μ m的石蜡切片; 切片通过常规脱蜡、水化; 再经苏木素染色细胞核, 伊红染色细胞质; 最后经过水化透明, 中性树脂封片, 在光镜下阅片。

1.2.5 小鼠脑组织切片免疫组织化学染色 组织标本经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后, 制成厚度为4 μ m的石蜡切片; 切片经常规脱蜡、水化; 再经枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）高温修复、30% H₂O₂室温封闭、1% Triton打孔、滴加1% BSA封闭; 后加兔抗鼠CD4或CD8抗体（1∶ 400稀释）, 经4 ^oC孵育过夜; 次日切片经PBS洗涤后, 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗, 室温孵育30 min; 后经PBS洗涤、DAB显色, 最后经过水化透明, 中性树脂封片, 在光镜下阅片。后计数100倍镜下15个视野中的CD4⁺T细胞, CD8⁺T细胞的数量。

1.2.6 小鼠脑组织切片间接免疫荧光染色 组织标本经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋, 制成厚度为4 μ m的石蜡切片; 切片通过常规脱蜡、水化、枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）高温修复、1% Triton打孔、1% BSA封闭; 后滴加鼠源JEV E蛋白4G2单克隆抗体（1∶ 400倍稀释）, 于4 ^oC冰箱孵育过夜; 次日滴加山羊抗鼠Alexa Fluor® 488抗体（1∶ 1 000倍稀释）室温孵育1 h; 后经PBS洗涤后, 滴加含DAPI的荧光封片剂; 封片后在荧光显微镜下阅片。

1.2.7 细胞体外感染及药物干预实验 Vero细胞于含有5% FBS的MEM常规培养基中培养, 待生长状况良好时铺于24孔板, 当细胞长至90%融合度时感染JEV（MOI=1), 以未感染JEV的细胞作为对照组（MOCK）, 以感染JEV但进行未药物干预的细胞作为感染组（JEV）, 以感染JEV且进行药物干预（舒尼替尼5 d给药）的细胞作为治疗组（sunitinib+JEV）, 每组设置3个复孔。后将24孔板放于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中吸附1 h（每隔15 min摇匀1次）, 病毒吸附完成后, 将治疗组Vero细胞用浓度为10^-3μ mol/L的舒尼替尼进行药物干预, 后放于37 ^oC、5% CO₂细胞培养箱中培养24 h。

1.2.8 细胞间接免疫荧光染色 Vero细胞经4%多聚甲醛固定、1% Triton打孔、1% BSA封闭; 后滴加鼠源JEV E蛋白4G2单克隆抗体（1∶ 400倍稀释）, 放置于4 ^oC冰箱孵育过夜; 次日滴加山羊抗鼠Alexa Fluor® 488荧光二抗（1∶ 1 000倍稀释）室温孵育1 h; 经PBS洗涤后, 滴加含DAPI的荧光封片剂, 在荧光显微镜下观察。

1.2.9 统计学分析 采用统计软件GraphPad Prism 8.0.1进行统计分析, 总体生存率采用Kaplan-Meier法计算, 体重变化和小鼠脑内病毒RNA载量采用双因素方差分析法, CD4及CD8阳性细胞计数采用Mann-Whitney 检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.10 动物福利和伦理声明 本研究中与动物相关的实验方案均在首都医科大学实验动物福利和伦理委员会进行备案。动物实验过程中, 在实验允许的情况下, 尽可能地减少动物用量, 增加单个动物的利用度。小鼠在处死前均先行用 3.5%水合氯醛进行麻醉处理以减轻动物处死时的痛苦。

两实验组生存率均为90%, 但在体重变化上连续治疗5 d实验组差异更显著。表明舒尼替尼在动物体内能够有效提高生存率, 且连续治疗5 d的效果更好（图1）。因此, 我们给BALB/c小鼠攻毒JEV后, 连续5 d腹腔注射舒尼替尼, 并记录每日体重变化。对照组给与等量PBS溶液。实验结果显示, 在攻毒后第6天, 两组小鼠均开始发病。对照组小鼠体重连续下降, 在攻毒后第15天较体重最高点降低10%左右。sunitinib 5 d组小鼠的体重在攻毒后保持稳定, 在第12天才略有下降, 后又回升至接近最高时水平。与体重变化相比, 小鼠生存率变化更显著。对照组在攻毒后第5天起陆续死亡, 在攻毒15 d后, 生存率已降至50%, 而sunitinib 5 d组小鼠生存率则为80%（P<0.01）, 表明舒尼替尼能够明显减轻JEV感染造成的死亡。见图2。

图1

Fig. 1

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	图1 不同舒尼替尼给药天数对小鼠生存率和体重变化的影响Fig. 1 Survival rate and body weight changes of mice on different days of sunitinib administration

图2

Fig. 2

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	图2 舒尼替尼对JEV感染小鼠存活率和体重变化的影响 A. 小鼠体重变化情况; B. 小鼠生存率变化情况; sunitinib 5 d vs PBS组, P<0.05。Fig. 2 Survival rate and body weight changes of JEV-infected mice with sunitinib administration A. The body weight changes; B. Survival rate changes; sunitinib 5 d group vs PBS group, P<0.05.

结果表明, 经过舒尼替尼治疗后, 小鼠脑内病毒的RNA水平呈现下降趋势, 但与对照组相比差异无统计学差异（P>0.05）。见图3。

图3

Fig. 3

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	图3 小鼠脑组织中JEV的RNA载量Fig. 3 The JEV RNA load in brain tissue of mice detected by qRT-PCR

相较于感染组, 治疗组小鼠的脑组织切片经HE染色后血管套袖样改变明显减少, 且染色较感染组颜色浅, 这一现象表明, 舒尼替尼治疗可缓解小鼠脑炎症状。见图4。

图4

Fig. 4

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	图4 JEV感染后各组发病小鼠大脑皮层HE染色（×100）Fig. 4 The mice brain in each group detected by HE staining during JEV encephalitis(×100)

相较于PBS组, 舒尼替尼组小鼠脑组织切片中的CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞数量明显减少, 且这种变化在大脑皮层、海马区及小脑部位均存在。计数结果显示, 舒尼替尼治疗组与PBS组相比, CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分别减少45%和23%, 均具有统计学差异。这一结果表明, 舒尼替尼可通过减少脑内炎性细胞浸润而缓解JEV感染造成的脑炎。见图5。

图5

Fig. 5

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图5 JEV脑炎发生时脑内 T 淋巴细胞的浸润状况 A. 脑内CD4+T细胞浸润状况代表性免疫组织化学染色图像（×100）; B. 脑内CD8+T细胞浸润状况代表性免疫组织化学染色图像（×100）; C. 小鼠脑内CD4+T细胞计数; D. 小鼠脑内CD8+T细胞计数; 每个点代表一个视野（n=3）; ** . P<0.01。Fig. 5 Infiltration of T lymphocytes in the brain during JEV encephalitis A. Representative IHC image of intracranial CD4+T cell infiltration (×100); B. IHC image of CD8+T cell infiltration in the brain (×100); C. Count of CD4+ T cells in mice brain; D. Count of CD8+ T cells in micebrain. Each dot represents a field of vision (n=3); ** . P<0.01.

舒尼替尼治疗组与PBS组相比, 脑内JEV抗原表达在小鼠大脑皮层、海马区及小脑均有不同程度减少。这一结果提示, JEV感染小鼠在舒尼替尼治疗后, 脑内JEV病毒复制减轻。见图6。

图6

Fig. 6

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	图6 JEV脑炎发生时小鼠脑内病毒抗原的表达情况（间接免疫荧光染色, ×100） A. sunitinib 5 d组小鼠脑组织各区中4G2的表达情况; B. PBS组小鼠脑组织各区中4G2的表达情况。Fig. 6 Expression of viral antigens in the brain detected by indirect immunofluorescence staining during JEV encephalitis( indirect immunofluorescence staining, ×100) A. Expression of 4G2 in brain of sunitinib 5 d group; B. Expression of 4G2 in brain of PBS group.

未感染的对照组（MOCK）没有出现细胞病变效应; JEV感染组（JEV） 在感染2 h后出现严重病变效应, 细胞有大量脱落; 舒尼替尼治疗组的受感染细胞虽然也出现一定病变效应, 但程度较感染对照组轻。见图7。

图7

Fig. 7

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	图7 JEV感染后体外sunitinib治疗Vero细胞明场观察（×200）Fig. 7 Vero cells treated with sunitinib in vitro after JEV infection detected by optical microscope （×200）

对照组（MOCK）无阳性染色; JEV感染组（JEV）在24 h后阳性染色细胞增多; 舒尼替尼治疗组的受感染细胞也出现一定阳性染色, 但数量较对照组少。见图8。

图8

Fig. 8

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	图8 JEV感染后体外治疗Vero细胞间接免疫荧光染色（×200）Fig. 8 Vero cells after JEV infection detected by indirect immunofluorescence staining (×200)