引用本文
郎俊英, 李桂梅, 孙鹏, 杨丽敏, 张美仁, 马晓辰, 李斌. 黄连提取物抑制结核分枝杆菌的机理初探[J]. 中国热带医学, 2022,22(2): 123-128
LANG Jun-ying, LI Gui-mei, SUN Peng, YANG Li-min, ZHANG Mei-ren, MA Xiao-chen, LI Bin. Preliminary study on inhibition mechanism of Coptis extract against Mycobacterium tuberculosis [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2022,22(2): 123-128.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.02.06
Permissions
黄连提取物抑制结核分枝杆菌的机理初探
郎俊英1,5, 李桂梅1#, 孙鹏2, 杨丽敏2, 张美仁1, 马晓辰4, 李斌3,*
1. 呼和浩特市第二医院,内蒙古 呼和浩特 010020
2.内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特 010051
3.呼和浩特市第一医院,内蒙古 呼和浩特 010031
4.兴安职业技术学院,内蒙古 乌兰浩特 137400
5. 呼和浩特市职业病医院,内蒙古 呼和浩特 010020
李斌, E-mail：13664749516@163.com

作者简介：郎俊英（1975—）,女,硕士,主任医师,研究方向：结核病。李桂梅（1968—）,女,硕士,主任医师,研究方向：中医学。#李桂梅同为第一作者

收稿日期: 2021-10-12
资助项目: 内蒙古自治区应用技术研究与开发资金计划项目（No. 201702123）
摘要
目的 研究黄连提取物在体内及体外对结核分枝杆菌的抑制作用及部分机理。方法 本实验用体外抑菌试验和体内造模实验检测黄连提取物抑制结核分枝杆菌（H37Ra）的作用及机理。抑菌试验：将黄连提取物按不同浓度添加到分枝杆菌固体培养基中,在培养基表面滴加H37Ra菌液,设空白组、利福平组做为对照,37 ℃培养2个月,观察有无菌落生长。造模实验：用结核分枝杆菌减毒株H37Ra感染小鼠,分为未感染组（正常组）、感染未治疗组（模型组）、感染治疗组（黄连组、利福平组）。做结核菌素试验验证造模阳性率,用ELISA实验检测小鼠血清IL-2的表达,使用RNA-seq检测小鼠肺的基因型改变。结果 体外抑菌试验结果显示除空白组外其他各组均未见菌落生长,证明黄连提取物对结核菌有抑制作用。造模实验的结核菌素试验阳性率63%,证明造模成功。小鼠血清IL-2的表达显示黄连组IL-2的表达升高。小鼠肺RNA-seq检测测得数百条有意义的差异基因,揭示了黄连提取物抑制结核杆菌的作用机制, 如Vipr2提高小鼠的细胞免疫,H2-Ea增强小鼠抵抗肺纤维化等。结论 黄连提取物对结核分枝杆菌有抑制作用且抑制机理是多渠道、多靶点的。
关键词: 黄连提取物; H37Ra; RNA-seq; Vipr2; H2-Ea
中图分类号:R378.91+1;R282.6 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)02-123-06
Preliminary study on inhibition mechanism of Coptis extract against Mycobacterium tuberculosis
LANG Jun-ying1,5, LI Gui-mei1, SUN Peng2, YANG Li-min2, ZHANG Mei-ren1, MA Xiao-chen4, LI Bin3,*
1. Hohhot Second Hospital, Hohhot, Inner Mongolia 010020, China
2. Inner Mongolia Medical University, Hohhot, Inner Mongolia 010051, China
3. The First Hospital of Hohhot City, Hohhot , Inner Mongolia 010031, China
4. Xing 'an Vocational And Technical College, Ulanhot, Inner Mongolia 137400, China
5. Hohhot Occupational Disease Hospital, Hohhot, Inner Mongolia 010020, China
Corresponding author: LI Bin, E-mail: 13664749516@163.com
Abstract
Objective To study the inhibitory effect of Coptis extract on Mycobacterium tuberculosis in vivo and in vitro, and its partial mechanism.Methods The inhibitory effect and mechanism of Coptis extract against Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) were detected by Bacteriostatic test in vitro and modeling test in vivo. Bacteriostatic test: Coptis extract was added to the solid medium of Mycobacterium according to different concentrations, and H37Ra bacterial solution was dropped on the surface of the medium. The blank group and rifampicin group were set as the control group. Culture at 37 ℃ for two months, and the colony was observed. Model experiment: Mice were infected with Mycobacterium tuberculosis attenuated strain H37Ra and divided into uninfected group (normal group), infected untreated group (model group) and infected treatment group (Coptis extract group and rifampicin group). Tuberculin test was performed to verify the positive rate of model making, the expression of IL-2 in serum was detected by ELISA, and the genotype change of lung was detected by RNA-seq.Results In vitro bacteriostatic test showed that no colony growth was observed in all groups except blank group, which proved that Coptis extract had inhibitory effect on tuberculosis bacteria. The positive rate of tuberculin test in modeling experiment was 63%, which proved that modeling was successful. The expression of IL-2 in mouse serum showed that increased in the coptis group. Hundreds of significant differentially expressed genes were detected by RNA-seq assay in the lung of mice, revealing the mechanism of the coptis extract against M. tuberculosis, such as Vipr2 enhancing cellular immunity in mice, h2-Ea enhancing resistance to pulmonary fibrosis in mice, etc.Conclusion Coptidis extract has an inhibitory effect on M. tuberculosis and the inhibitory mechanism is multi-channel and multi-target.
Key words: Coptis extract; H37Ra; RNA - seq; Vipr2; H2-Ea

结核病由结核分枝杆菌的感染引起, 是单一致病菌死因的第一位疾病。目前用于治疗结核病的药物仍以研制于20世纪五六十年代的异烟肼、利福平、乙胺丁醇等为主, 这些药物经过超半个世纪的使用已经产生明显的耐药性。据2000年全国结核病流行病学抽样调查结果显示, 我国结核分枝杆菌总耐药率为27.8%[1]。黄连是一味药效广泛的常用中药, 具有广谱抗菌作用, 临床主要用于肠道菌引起的胃肠炎的治疗。其主要成分是小檗碱, 俗称黄连素[2]。姜园园等对20多种中药提取物进行多药耐药结核菌及标准株H37Rv的体外抗菌效果检测, 结果显示黄连粗提物效果最佳, 其活性成分为生物碱, 与小檗碱的体外抗结核作用相同[3]。黄连提取物是内蒙古医科大学近年研制出的药物, 采用低温冷冻的方法提取（专利名称：一种从黄连提取有效成分的方法及该提取物用途; 专利号：250574607.5）, 主要成分是生物碱[4], 通过实验已经证明具有明显抗肿瘤 [4]、抗疟 [5]等的作用。本实验研究黄连提取物对结核菌的抑菌作用及机理, 为运用黄连治疗结核病提供基础研究。

1 材料与方法
1.1 材料

结核分枝杆菌减毒株（H37Ra, ATCC 25177）, 购买自ATCC公司; 分枝杆菌液体培养基Middlebrook 7H9, 购买自ELITE-MEDIA; 分枝杆菌固体培养基Middlebrook 7H10, 购买自青岛海博; 黄连提取物, 由内蒙古医科大学杨丽敏老师馈赠; 注射用利福平, 购买自重庆华邦; 结核菌素纯蛋白衍生物, 购买自北京祥瑞; 白细胞介素2（IL-2）ELISA试剂盒, 购买自RayBio; 昆明小鼠, 购买自内蒙古大学实验动物研究中心（许可证号：SCXK（蒙）2016-0001）。小鼠实验是在内蒙古医科大学实验动物中心（许可证号：SYXK（蒙）2020-0003）进行。本实验经斯贝福（北京）生物技术有限公司实验动物伦理委员会审核通过（批准文号：AWE2019052701）。其他实验在呼和浩特市第二医院生物安全BSL-2级实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 抑菌试验 将H37Ra用Middlebrook 7H9培养基培养2个月得到2× 105 CFU/mL的菌液。将黄连提取物按不同剂量添加到Middlebrook 7H10培养基中, 得到黄连提取物浓度为5.0、4.0、2.5、1.0、0.5 mg/mL的分枝杆菌固体培养基; 用同样的方法得到利福平浓度为40 μ g/mL的固体培养基, 作为对照; 设空白组（培养基不加任何药液）对照; 设3个重复。然后各组固体培养基表面滴加H37Ra菌液（2× 105CFU/mL）10 μ L, 37 ℃度恒温培养, 每天观察有无菌落生长。

1.2.2 造模实验 用昆明小鼠造模, 小鼠3~4周龄, 体重18~20 g, 分为未感染组即正常对照组（ZC）、感染未治疗组即模型组（MX）、黄连提取物治疗组（H）、利福平治疗组(L), 共四组, 每组10只, 雌雄各半。

ZC组小鼠未做任何干预, 正常饲养; MX组在造模后正常饲养; 用药组在造模后给予药物治疗, 给予正常饮食作息。 造模：在小鼠鼻粘膜和口腔鼻咽部给H37Ra菌液（2× 105 CFU/mL）各10 μ L, 每日1次, 连续3 d。给药：在造模后翌日[6]对用药组小鼠灌胃给药。H组小鼠给予用生理盐水配制的浓度为5 mg/mL的黄连提取物溶液1 mL/(d· 只); L组小鼠给予用生理盐水配制的浓度为2 mg/mL的利福平溶液1 mL/(d· 只)。连续2个月。各组小鼠在1月末, 腹部祛毛, 皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物50 μ L, 24 h观察结果。各组小鼠在2月末, 腹腔注射0.1 mL浓度1%戊巴比妥钠注射液, 麻醉成功后, 摘眼球取血2 mL, 从右心耳注射生理盐水冲洗肺部血液后取肺, 颈椎脱臼处死小鼠, 肺组织即刻冻于-80 ℃冰箱备用, 血液离心后取血清储存于-20 ℃冰箱备用。

取储存于-20 ℃冰箱的小鼠血清做IL-2的检测, 按ELISA试剂盒说明书进行。取速冻于-80 ℃冰箱的小鼠肺组织, 挑选结核菌素试验结果阳性样本, 每组选3个, 避免融冻, 委托北京奥维森基因科技有限公司进行转录组高通量检测。

1.2.3 小鼠RNA-seq 用 Illumina 二代高通量测序平台, 采用PE150测序策略, 分别利用star和Cufflinks 软件完成比对和转录本拼接分析, 然后对所有基因进行定量分析, 并根据差异组合, 鉴定差异基因, 随后对这些差异基因进行功能富集分析。

2 结 果
2.1 抑菌试验

含有黄连提取物或利福平的分枝杆菌固体培养基上, 未见菌落生长, 只有未添加任何药液的空白组培养基上, 一个月时可见有米白色菌落生长, 菌落涂片做抗酸染色, 证实是抗酸分枝杆菌。结果见表1。抑菌试验证明黄连提取物对结核分枝杆菌有抑制作用。

表1 黄连提取物对H37Ra生长的抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of Coptis extract on the growth of H37Ra
2.2 造模实验

2.2.1 结核菌素试验 在小鼠腹部皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物24 h后, 注射部位出现红色硬结（直径≥ 3 mm）为阳性（图1）。正常组小鼠全部阴性, 模型组和用药组小鼠的阳性率为63%, 模型组和用药组小鼠的阳性率差异无统计学意义。

图1 小鼠结核菌素试验阳性结果Fig. 1 Positive results of the tuberculin test in mice

2.2.2 ELISA检测IL-2结果 从图2可以看出, 模型组比较于正常组, IL-2的表达值明显下降, 差异有统计学意义; 黄连组、利福平组的IL-2水平较模型组升高, 黄连组与模型组相比差异有统计学意义。利福平组与模型组相比IL-2水平未达到统计学意义, 可能与利福平的作用机制不同有关, 究其原因有待进一步研究。

图2 IL-2 的 ELISA检测结果Fig. 2 ELISA result of IL-2

2.3 小鼠肺RNA-seq结果

2.3.1 差异基因分析 图3的A、B、C 图分别是ZC、H、L组与MX组比较的差异基因火山图, 差异基因筛选标准: P< 0.05。图D是 H vs MX和ZC vs MX的差异基因绘制的维恩图, 显示两组有76条差异基因是相同的, 这76条基因既是正常小鼠感染结核菌前与感染后相比较（ZC vs MX）表达改变的基因, 也是感染结核小鼠用黄连治疗后与治疗前相比较（H vs MX）表达改变的基因, 是因感染结核菌而由正常改变了的基因用黄连治疗后又恢复到正常的基因, 是我们的目的基因。图E是H vs MX、ZC vs MX 和L vs MX的差异基因绘制的维恩图, 显示三组有10条共同的差异基因。这10条基因既是正常小鼠感染结核菌前与感染后相比较（ZC vs MX）表达改变的基因, 也是感染结核小鼠用黄连治疗后与治疗前相比较表达改变的基因, 也是感染结核小鼠用利福平治疗后与治疗前相比较表达改变的基因, 是我们要重点关注的基因, 我们从其中选取2条基因Vipr2、H2-Ea进行分析。

图3 差异基因图示
A. ZC vs MX差异基因的火山图；B. Hvs MX差异基因的火山图；C. L vs MX差异基因的火山图；D. H vs MX和ZC vs MX差异基因维恩图；E:H vs MX、ZC vs MX、_L vs MX差异基因维恩图。Fig.3 Differential gene mapping
A. The volcano plot of ZCvs MX differential expressed genes; B. The volcano plot of H vs MX differential expressed genes; C. The volcano plot of L vs MX differential expressed genes; D. H vs MX and ZC vs MX differential expressed genes venn; E. H vs MX, ZC vs MX, L vs MX differential expressed genes venn.

血管活性肠肽受体2（vasoactive intestinal peptide receptor 2, Vipr2）, Gene_id：ENSMUSG00000011171, H vs MX、ZC vs MX、L vs MX它的表达值都是上调的, 见表2。ZCvsMX的Vipr2是显著上调的, 说明结核菌的感染使小鼠Vipr2的表达下降; H vs MX、L vs MX的Vipr2是显著上调的, 说明用药后, Vipr2上调。

表2 Vipr2在各组中的表达值 Table 2 Expression values of Vipr2 in each group

组织相容性Ⅱ 类抗原Ea（histocompatibility 2, class Ⅱ antigen E alpha, H2-Ea）, Gene_id：ENSMUSG000000363 22, H vs MX、ZC vs MX、L vs MX它的表达值也都是上调的, 见表3。ZC vs MX中的H2-Ea是显著上调的, 说明结核菌的感染使小鼠H2-Ea的表达下降; H vs MX、L vs MX中的H2-Ea是显著上调的, 说明治疗后, H2-Ea上调。

表3 各组H2-Ea的表达值 Table 3 Expression values of H2-Ea in each group

2.3.2 KEGG通路富集分析 图4和图5是根据H vs MX的差异基因经KEGG富集分析得到的KEGG富集散点图, 图4上调, 图5下调。从图4中可以看出上调的基因中, 富集通路主要有低氧诱导的信号通路（HIF-1）、cAMP信号通路、抗原加工提呈、糖胺聚糖的生物合成等。从图5中可以看出下调的基因中, 富集通路主要有原发性免疫缺陷等。

图4 HvsMX 上调表达基因富集的KEGG通路散点图Fig.4 The scatter plot of KEGG pathways enriched for H vs MX up-regulated expression genes

图5 Hvs MX下调表达基因富集的KEGG通路散点图Fig. 5 The scatter plot of KEGG pathways enriched for Hvs MX down-regulated expression genes

3 讨论

H37Ra系Steeken等在1934年从H37中分离获得的人型结核分枝杆菌减毒株, 具有毒株H37Rv的免疫原性[7]。我们用H37Ra造模, 可以很好的从免疫学的层面研究黄连提取物对结核分枝杆菌的抑制机理。

基因组测序技术近年发展迅猛, 为研究药物作用机理, 发现药物靶标, 进而为研究创新药物提供了技术支撑。本文用基因测序的方法探讨了黄连提取物抑制结核杆菌的作用机理, 为研发抗结核菌新药提供了宝贵线索。我们测得近百条有意义的差异基因和诸多信号通路, 并分析了其中的两条：Vipr2 和 H2-Ea。Vipr2是T细胞在胸腺发育的主要中介物, 诱导CD4+8+到CD4+8- 的分化[8]。IL-2主要由CD4+ T细胞产生, 可以刺激T细胞增殖及产生细胞因子, 促进自然杀伤细胞的细胞毒活性[9]。HvsMX、LvsMX中Vipr2的上调表达, Vipr2促进T细胞成熟, 增加IL-2的产生, 发挥抗结核的作用。当感染结核菌时, IL-2与IL-2受体结合, 促进T细胞的复制, 参与肉芽肿的形成[10]。H2-Ea是小鼠肺纤维化的易感基因, 有保护小鼠免于罹患肺纤维化的作用[11], 结核菌最易侵犯肺部, 形成纤维化是它的一个病理类型 [12]。HvsMX, LvsMX, H2-Ea表达上调, H2-Ea增强小鼠抵抗肺纤维化的能力来抵抗肺结核。HvsMX, HIF-1信号通路增强, 它是机体在低氧环境下产生的适应性反应通路, 增强机体对缺氧的耐受[13]。黄连可以上调HIF-1信号通路, 促进缺血部位血管生成改善血循环[14]。HvsMX, cAMP信号通路增强, 抗原加工提呈通路增强。HvsMX糖胺聚糖的生物合成增强：糖胺聚糖是蛋白聚糖的主要成分, 蛋白聚糖最主要的功能是构成细胞间的基质。糖胺聚糖有助于蛋白聚糖吸引水、保留水而形成凝胶, 容许小分子化合物自由扩散而阻止细菌通过, 起保护作用[15]。HvsMX原发性免疫缺陷通路下调。可以看出黄连提取物抑制结核分枝杆菌的作用机制是多方面的。我们测得的每一条差异基因和每一个信号通路都值得我们去深入探究, 这会是非常有意义的工作。

黄连除具有抗结核菌的作用外, 还具有抑制细菌抗药性产生的作用。王忠义等通过分析基因转录谱数据, 发现来自黄连的小檗碱具有显著上调DNA修复酶, 下调抗氧化酶的作用, 从而抑制细菌耐药性的产生, 而且对比了多种化学的或天然的杀菌剂, 它们对DNA修复酶的上调作用, 减少抗药性突变, 均远不如小檗碱[16]。黄连含有多种生物碱, 其中以小檗碱 （黄连素）含量最高 [2] 。黄连提取物是一种混合物, 主要成分是生物碱。天然药物含多个组分, 可同时作用多个靶点, 可明显抑制细菌耐药性的产生[16] 。现今, 结核分枝杆菌的耐药性已成为全球关注的重大公共卫生挑战 [17]。而且, 黄连的副作用很小 [18], 相较于传统抗结核药物异烟肼、利福平等肝损伤毒副作用大的情况这又是一个突出的优点。所以, 黄连不论从它的抗结核作用、还是它的抑制耐药性的产生、以及它的毒副作用小的方面都是一个绝好的治疗结核病的药材。黄连还具有治疗肺部疾病的优势, 如有研究表明黄连素能诱导IL-12细胞因子的表达, 起到抑制呼吸道炎症的作用[19] 。黄连素可抑制肺组织细胞对促炎因子TNF-α 、IL-lβ 的释放, 达到治疗肺部炎症的作用 [20]。有研究表明, 小鼠气管内受到抗原（绵阳红细胞）刺激后Vipr2显著增加, IL-2上升[21] , 这与我们的实验结果相一致。总之, 黄连提取物可以抑制结核分枝杆菌, 其作用机理是多渠道、多靶点的, 它是一个非常有潜力的治疗结核病的中药。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：谢永慧

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