将埃及伊蚊的蚊卵放置于30 cm× 25 cm× 8 cm盛有水的饲养盆中, 在温度为（26±1） ℃、相对湿度为80%±5%, 光控周期（光照14 h, 黑暗10 h）下培养。待成蚊羽化后, 用8%浓度白砂糖糖水饲喂。在埃及伊蚊的生长周期中, 对蚊卵、1~4龄幼虫、白蛹、黑蛹、雄性成蚊、雌性成蚊进行收集。另外特别针对羽化后3 d的雌性埃及伊蚊, 在体视显微镜（Saikedigital, Shenzhen, China）下使用解剖针对其成虫进行组织解剖, 分别收集头部、胸部、附肢、表皮、卵巢和中肠等不同组织样品, 每个发育阶段以及每个组织收集3管做为生物学重复, 用于后续研究DDC基因在埃及伊蚊不同发育阶段、不同组织部位的表达情况。

为了研究Ae-DDC（GenBank登录号AAE L014238）在埃及伊蚊不同发育阶段、雌性成蚊不同组织的基因表达情况, 我们将收集到的埃及伊蚊每个发育阶段以及每个组织样本分组, 使用Trizol法进行总RNA的提取, 每组样本进行3次生物学重复实验。用PrimeScript™ RT试剂试剂盒（TaKaRa, 日本）去除基因组并反转录生成模板cDNA, 进行3次生物学重复实验。使用Primer 5软件设计DDC基因实时荧光定量PCR 引物（DDC-F：5'-CCTTTGTCTGTCCAGAATA TCG-3', DDC-R：5'-GTTCCTTCAGAGCCACATAGC-3' ）, 用于扩增cDNA片段（产物片段大小为125 bp）, 使用埃及伊蚊核糖体蛋白S17(RPS17)基因（GenBank登录号AAEL025999）作为参考基因。RT-qPCR在LightCycler 96仪器（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）中进行, 反应体系（10 μ L）为：cDNA（10× ） 1 μ L, SYBR Green 4 μ L, qRT-Primer F 1 μ L, qRT-Primer R 1 μ L, ddH₂O 3 μ L。RT-qPCR反应条件为：95° C预变性10 min, 95 ° C 10 s, 55 ° C 10 s, 72 ° C 30 s, 40个循环。在PCR反应结束时, 生成溶解曲线, 以评估PCR引物特异性。根据扩增的循环数（CT值）, 采用2^{-Δ Δ ct}方法对数据进行相对定量分析。使用Graphpad Prism 9对数据进行统计分析并绘制统计图, 后续RT-qPCR实验数据分析过程与此相同。实时荧光定量PCR反应完成后, 通过溶解曲线分析和1%琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的特异性。

用Trizol法（Invitrogen, 美国）提取埃及伊蚊雌蚊成蚊总RNA, 然后用PrimeScript™ RT试剂试剂盒（TaKaRa, 日本）去除基因组并反转录生成模板cDNA。使用Primer 5软件设计DDC基因的PCR 引物（DDC-F：5'-ACCTCAAGCCCCTTATCC-3' , DDC-R：5'-GCAAACCTGCTCGTTCTAC-3'）并从cDNA中扩增出目的片段（产物片段大小为492 bp）, PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化, 使用限制性内切酶XhoⅠ 、NotⅠ 将pL4440载体双酶切为空载, 再用T4 DNA连接酶将目的片段连接到具有T7聚合启动子的pL4440载体中, 组成目的片段和载体的重组质粒。将重组质粒转化到HT115 （DE3）感受态细胞中^[13], 转移到LB培养基中, 37 ℃摇床过夜培养表达, IPTG终浓度为0.6 mmol/L。最后Trizol法提取表达的dsRNA（方法同上）并纯化, 1%琼脂糖凝胶电泳验证。

取孵化后3~5 d的埃及伊蚊雌蚊成蚊, 每次数量控制在300只左右, 注射180只, 多出的埃及伊蚊备用, 将注射后蚊子以及备用蚊子放入-20 ° C的冰箱中冷冻麻醉4 min。将冷冻麻醉的成蚊放入培养皿并置于冰上, 将DEPC水和dsGUS作为对照组, dsDDC作为实验组, 一共3组, 每组注射60只, 保证每组埃及伊蚊存活40只以上, 每组生物学实验重复3次。使用油压手动微量注射装置（Eppendorf AG, 汉堡, 德国）注射至冷冻麻醉后成蚊的胸腔内。在每只雌性成蚊胸腔侧面等量注射1 μ L, 称重判断注射量, 注射后将埃及伊蚊转移至蚊笼中饲养24 h后, 通过RT-qPCR检测DDC基因的转录水平, 进而评估注射后RNA干扰DDC基因效率。使用Graphpad Prism 9对数据进行统计分析并绘制统计图。

为了探讨DDC对埃及伊蚊产卵的影响, 将注入dsDDC的40只雌性成蚊与野生雄蚊（1雌2雄）进行交配。另外两组对照组同样处理。交配完成后, 将雄蚊取出, 将雌性埃及伊蚊转移至蚊笼中, 24 h后喂血。喂血后, 在雌蚊所在试管底部放入产卵纸, 观察其产卵量。将每只埃及伊蚊产卵纸转移至室温26 ℃, 相对湿度为90%±5%的盒子中进行保存, 将其放置3 d后拿出产卵纸进行孵化, 观察蚊卵孵化情况, 并统计孵化率。使用Graphpad Prism 9对数据进行统计分析并绘制统计图。

埃及伊蚊在室温(28±2) ℃, 湿度75%±5%的条件下饲养, 于产卵后第4天, 用水份检测器（型号MT-15）对湿度进行检测, 在保存产卵纸的盒子中（室温26 ℃, 湿度90%±5%）, 借助小毛刷, 将卵从湿润卵纸（室温26 ℃, 50%±5%湿度）转移到干燥载玻片上（室温26 ℃, 湿度0~5%）, 在脱水后的第2分钟和第10、20、30分钟利用显微镜观察记录, 对实验组和对照组的卵在同一显微镜视野下进行拍照, 并记录其干瘪情况。

采用Graphpad Prism 9进行处理数据并分析, DDC基因的荧光定量时空表达谱以及RT-qPCR检测干扰后DDC基因的相对表达量等数据处理采用t检验, dsDDC埃及伊蚊的产卵量采用Mann-Whitney rank sum test进行数据处理, dsDDC埃及伊蚊的卵孵化率采用χ²检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

用RT-qPCR检测DDC基因在埃及伊蚊不同生长发育周期的相对表达量。时间表达谱转录本包括卵、幼虫、蛹、成虫等9个不同的发育阶段, 其中DDC在卵时期表达量显著高于其他发育时期幼虫, 差异有统计学意义（P< 0.01）; 雌性白蛹表达量约是雄性黑蛹的3.46倍, 差异有统计学意义（P< 0.01）; 雄性成蚊表达量高于雌性成蚊, 但差异无统计学意义（P> 0.05）。见图1。

图1

Fig. 1

Figure Option ViewDownloadNew Window

图1 DDC基因在埃及伊蚊生长周期的相对表达量 Egg、L1、L2、L3、L4、W、B、F、以及M分别代表了埃及伊蚊的卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫、雌性白蛹、雄性黑蛹、雌性成蚊和雄性成蚊; * . P< 0.01。Fig. 1 Relative expression levels of DDC genes in the growth cycle of Aedes aegypti Egg, L1, L2, L3, L4, W, B, F, and M represent Aedes aegypti eggs, first-instar larvae, second-instar larvae, third-instar larvae, fourth-instar larvae, female white pupae, male black pupae, adult mosquito females, and adult mosquito males, respectively; * . P< 0.01.

用RT-qPCR检测DDC基因在埃及伊蚊不同组织中的相对表达量。空间表达谱转录本包括成蚊的头部、附肢、胸部、表皮、中肠和卵巢共计6个不同组织。DDC在埃及伊蚊头部表达量高于胸和表皮, 胸和表皮阶段表达量基本一致, 而在中肠中表达量显著降低（图2）。DDC在卵巢中转录本表达量水平约为胸部的5.35倍, 差异有统计学意义（P< 0.01）; DDC在卵巢中转录本表达量水平高于表皮和中肠, 分别是6.63倍和38.9倍, 差异有统计学意义（P< 0.01）。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 DDC基因在埃及伊蚊不同组织部位的相对表达量Fig. 2 Relative expression levels of DDC genes in different tissues of Aedes aegypti * P< 0.01。

通过Real-time Quantitative PCR（RT-qPCR）对RNA干扰后实验组的埃及伊蚊和同一时期对照组的蚊虫进行检测, 得到DDC基因的相对表达量。结果显示, 同对照组（DEPC和dsGUS）相比, 实验组DDC基因的表达量降低了70％左右, 差异有统计学意义（t=9.839, P< 0.01）, 而阴性对照组（dsGUS）与空白对照组（DEPC）之间差异无统计学意义（t=0.5588, P> 0.05）。见图3。

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 RT-qPCR检测干扰后DDC基因的相对表达量Fig. 3 Detection of relative expression of DDC gene after interference by RT-PCR * . P< 0.01。

为了研究3组样本产卵量的变化情况, 使用RNAi沉默DDC基因后统计了3组样本产卵量的变化情况。结果表明, DEPC组和dsGUS组的产卵量分别为122个/只蚊和120个/只蚊, 两组产卵量基本保持在同一水平, 差异无统计学意义（t=1.996, P> 0.05）; 而dsDDC组产卵量为39个/只蚊, 明显低于其他两组, 差异有统计学意义（t=49.68, P< 0.01）。见图4。

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 RNA干扰（注射）后成蚊的产卵量Fig. 4 Egg production of adult mosquitoes after RNA interference (injection) * . P< 0.01

RNAi后3组样本卵孵化率的统计见图5, DEPC组和dsGUS组的卵孵化率分别为95.1%和92.9%, 两组间差异无统计学意义（χ²=0.866 3, P> 0.05）, 而dsDDC组卵孵化率仅为10%, 明显低于其他两组, 差异有统计学意义（χ²=147.5, P< 0.01）。

图5

Fig. 5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 RNA干扰成蚊后卵的孵化率Fig. 5 Hatching rate of eggs after RNA interference into adult mosquitoes * . P< 0.01

在低湿度条件下dsGUS组的蚊卵在第10分钟蚊卵结构基本完好无损, 而在低湿度条件下dsDDC组蚊卵结构就已经基本坍塌。30 min时, 两组蚊卵饱和度具有明显差异, dsGUS组蚊卵饱和度依然很高, 而dsDDC组蚊卵已经出现严重失水, 明显干瘪的表型。见图6。

图6

Fig. 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 RNA干扰后卵的抗干燥能力观察（40） A~D图分别代表第2分钟、第10分钟、第20分钟、第30分钟蚊卵的饱和度变化。Fig. 6 Observation of anti-desiccation ability of eggs after RNA interference （40） A~D represent the saturation changes of mosquito eggs at the 2nd minute, 10th minute, 20th minute and 30th minute respectively.