引用本文
易佳, 孙凌聪, 张聪, 李博, 李凯杰. 湖北省2020—2021年疟疾诊断参比实验室血片镜检质量分析[J]. 中国热带医学, 2022,22(4): 324-328.
YI Jia, SUN Ling-cong, ZHANG Cong, LI Bo, LI Kai-jie. Quality of malaria blood smears of microscopic examinations in Hubei Provincial Malaria Diagnostic Reference Laboratory, 2020-2021[J]. China Tropical Medicine, 2022,22(4): 324-328.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.04.07
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湖北省2020—2021年疟疾诊断参比实验室血片镜检质量分析
易佳, 孙凌聪, 张聪, 李博, 李凯杰*
湖北省疾病预防控制中心,湖北 武汉 430079
*通信作者： 李凯杰,E-mail: 7856151@qq.com

作者简介：易佳（1989—）,女,硕士,主管技师,研究方向：寄生虫病检测与防控。

收稿日期: 2022-02-22
基金资助: 湖北省卫生健康委员会科研项目（No.WJ2019Q055）
摘要

目的 了解湖北省发热病人疟原虫血涂片制作质量和实验室人员疟原虫镜检能力水平,为消除疟疾后的有效监测提供技术保障。方法 对2020—2021年湖北省网络报告和疑似疟疾病例血片和随机抽取的各市州发热病人阴性血片进行镜检复核,对血片制作、染色、清洁度、镜检结果及虫种判定情况进行分析评价。结果 2020—2021年共复核疟原虫血片1 661张,制片、染色、清洁度总合格率分别为88.50%（1 470/1 661）、80.01%（1 329/1 661）、84.71%（1 407/1 661）。复核阳性病例63例,血片156张,阳性血片制片、染色、清洁度合格率分别是78.21%、76.92%、82.69%,阳性符合率为77.78%,虫种符合率为87.76%。恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的虫种符合率分别为94.74%、90.00%、80.00%和80.00%。复核阴性血片1 505张,阴性血片制作、染色、清洁度合格率分别为89.57%、80.33%、84.92%,复核一致率为100%,未发现漏检。阴阳性血片制作合格率差异有统计学意义（ χ2=17.933, P<0.05）,染色和清洁度合格率差异无统计学意义。血涂片质量主要存在的问题有沉渣较多、溶血不全、血膜制作不规范、染色深浅和厚血膜脱落。不同地区阴性血片质量差异有统计学意义（ χ2制作=73.109、 χ2染色=130.637、 χ2清洁度=68.806, P均<0.05）,且城市医院血片制作、染色和清洁度均优于乡镇卫生院（ χ2制作= 21.551、 χ2染色=13.561、 χ2清洁度=12.523, P均<0.05）。结论 湖北省各市州血涂片质量整体较好,阳性血片质量及疟原虫定性诊断能力有待进一步提高。

关键词: 疟原虫; 血片质量; 镜检; 复核
中图分类号:R531.3 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)04-324-05
Quality of malaria blood smears of microscopic examinations in Hubei Provincial Malaria Diagnostic Reference Laboratory, 2020-2021
YI Jia, SUN Ling-cong, ZHANG Cong, LI Bo, LI Kai-jie
Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention, Wuhan, Hubei 430079, China
Corresponding author: LI Kai-jie, E-mail: 7856151@qq.com
Abstract

Objective To understand the quality of production of blood slides and laboratory personnel's ability to microscopically examine Plasmodium at Hubei Province clinic inspection stations at all levels,so as to provide the technical support for malaria surveillance in the post-elimination period.Methods The negative blood slides from patients with a fever in various cities (states) and all the positive blood slides of the direct report of the network and suspected cases were microscopic examination reviewed from 2020 to 2021,the staining and cleanliness of the blood smears,microscopic examination results and the coincidence rate of positive blood species were comprehensively analyzed and evaluated.Results A total of 1 661 checked blood smears were reexamined in the year of 2020 to 2021. The qualification rate of blood smears preparation, dyeing, cleanliness were 88.50%（1 470/1 661）, 80.01%（1 329/1 661）and 84.71%（1 407/1 661）, respectively. 63 positive cases and 156 positive blood slides were reviewed, the qualification rate of positive blood smears preparation, dyeing, cleanliness were 78.21%, 76.92%, 82.69%, with an overall coincidence of 77.78% for malaria diagnosis, and 87.76% for Plasmodium species identification. The coincidence rates of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae identification were 94.74%, 90.00%, 80.00% and 80.00% during the re-examinations, respectively. Totally 1 505 negative blood smears were reviewed, with a consistence rate of 100%. The qualified rates of blood smear preparation, dyeing, cleanliness were 89.57%, 80.33%, 84.92%, respectively, and there were no leak detection. There was significant difference in the qualification rate of negative and positive blood smears preparation ( χ2=17.933, P<0.05), but there was no significant difference in dyeing and cleanliness. The main factors which affected the quality of blood smears were excessive sediment, hemolysis insufficiency, non-standard blood film production, depth and shallow colouring and the drop of thick blood membrane. There was an significant difference in the quality of negative blood slides among the different districts ( χ2production=73.109, χ2dyeing=130.637, χ2cleanliness=68.806, all P<0.05), and the production, dyeing and cleanliness in urban hospitals were better than those in township hospitals ( χ2production=21.551, χ2dyeing=13.561, χ2cleanliness=12.523, all P<0.05).Conclusions The quality of blood smears for Plasmodium detection in Hubei province is satisfying. But the positive blood slides quality and the qualitative diagnostic ability of Plasmodium in microscopy examination of positive cases should be improved in the future．

Keyword: Plasmodium; blood slide quality; microscopic examination; reexamination

湖北省曾是全国疟疾高流行区省份之一, 经过近70年的不懈努力, 全省疟疾防控工作取得了显著的成就[1, 2]。湖北省自2013年以来无本地感染疟疾病例, 并于2019年顺利通过国家卫生健康委员会组织的省级消除疟疾考核评估[3]。全省自2013— 2021年已连续9年无本地感染疟疾病例, 然而随着全球一体化进程的快速发展和“ 一带一路” 倡议的深入实施, 国际交往日益增多, 我省面临的境外输入性疟疾压力持续存在[4, 5]。

疟疾的快速、准确诊断是及时发现传染源, 规范治疗和防止继发传播的关键[6]。目前, 血涂片镜检仍是疟疾诊断的金标准[7], 该方法操作简单、成本较低、可鉴别虫种及计算原虫感染密度, 适用于各级实验室开展[8, 9]。而血涂片制作和染色的质量好坏直接影响镜检结果以及后续治疗用药[10]。因此, 疟疾血涂片的质量控制在疟疾诊断和防治工作中具有重要意义。为了解我省各级医疗机构发热病人血检工作质量, 进一步规范疟疾血涂片制作和镜检工作, 切实提高疟疾病患者发现率及可疑症状者及时就诊率, 省级疟疾诊断参比实验室每季度对全省各地医疗卫生机构的疟疾血片进行抽检复核。本文通过对我省2020— 2021年血片复核质量进行比较分析, 为及时发现疟疾血检工作中的薄弱环节, 巩固消除疟疾成果, 科学制订消除后阶段疟疾监测策略提供依据。

1 材料与方法
1.1 血涂片来源

2020— 2021 年湖北省疟疾诊断参比实验室每季度按50%比例随机抽取市级疾控中心复核后的发热病人阴性血片, 以及2020— 2021 年全省各市州疾控中心送检的疟疾网报病例和疑似病例待复核血涂片。

1.2 评价方法

由疟疾诊断参比实验室长期从事疟原虫镜检的专业技术人员根据《疟疾诊断标准（WS259-2006）》[11]镜检疟原虫, 查到疟原虫判断为阳性并进行虫种鉴别, 未检出疟原虫判断为阴性, 对血片制作、染色、清洁度质量进行评价。

1.3 血涂片质量评价标准[12]

1.3.1 血涂片制作 厚、薄血膜在同一张玻片上。厚血膜位于玻片右1/3处, 直径在0.8~1.0 cm, 用血量为4~5 µ L, 外观为圆形, 厚薄均匀; 薄血膜位于玻片左1/2~1/3处, 用血量为1.0~1.5 µ L, 外观为舌形, 无划痕。

1.3.2 血涂片染色 外观染色均匀, 酸碱适宜, 厚、薄血膜完整无脱落, 显微镜镜下细胞和疟原虫着色清晰。

1.3.3 血涂片清洁度 外观整洁干净, 无油渍灰尘, 显微镜下观察无沉渣、杂质、细菌等。

1.4 镜检结果评估

对所有血片逐片进行复核, 复检结果一致的判为相符血片, 阳性血片计算疟原虫虫种符合率; 初报镜检为阳性血片经复检为阴性, 判为误检血片; 初报镜检为阴性血片经复检为阳性, 则判为漏检血片。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计分析, 并采用χ2检验或Fisher确切概率法进行率的比较, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 镜检复核结果

2020— 2021年湖北省疟疾诊断参比实验室共镜检复核血片1 661张, 其中阴性血片1 505张, 阳性血片156张（网报阳性和疑似阳性病例63例, 每例均复核多张血片）。1 505张阴性血片镜检均为阴性, 符合率达100%, 未发现漏检。63例网报和疑似病例样品中镜检复核确认阳性病例49份, 阳性符合率为77.78%（49/63）, 虫种符合率为87.76%（43/49）, 恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的符合率分别为94.74%（18/19）、90.00%（9/10）、80.00%（4/5）、80.00%（12/15）, 差异无统计学意义（χ2=2.459, P> 0.05）, 未发现混合感染病例。合计定种误判 6 例, 1 例恶性疟误判为未分型, 1例间日疟误判为卵形疟, 1例三日疟误判为卵形疟, 3 例卵形疟中 2 例误判为间日疟、1例误判为恶性疟。

2.2 血片质量复核结果

2020— 2021年复核血涂片制作总合格率为88.50%（1 470/1 661）、染色总合格率为80.01%（1 329/1 661）、清洁度总合格率为84.71%（1 407/1 661）。阳性血片制片、染色、清洁度合格率分别是78.21%、76.92%、82.69%; 阴性血片制片、染色、清洁度合格率分别是89.57%、80.33%、84.92%, 阴、阳性血片制作合格率差异有统计学意义（χ2=17.933, P< 0.05）, 染色和清洁度合格率差异无统计学意义（P> 0.05）。不同年度之间阳性血片制作、染色、清洁度合格率差异均无统计学意义（P均> 0.05）; 阴性血片制作、染色的合格率差异均有统计学意义（χ2制作=8.868、χ2染色=7.628, P均< 0.05）, 血片的清洁度合格率基本一致, 差异无统计学意义（χ2=0.034, P=0.854）, 见表1。

表1 2020— 2021年湖北省疟疾诊断参比实验室血片质量复核结果 Table 1 Quality results of blood slides reexamination of Hubei malaria reference laboratory, 2020-2021
2.3 不同市州阴性血涂片质量对比分析

2020— 2021年共抽查全省17个市州的531家单位已检发热病人疟原虫阴性血片1 505张, 符合率为100.00%。不同市州之间血片制作合格率范围为75.00%~100.00%、染色合格率范围为41.07%~100.00%、清洁度合格率范围为64.94%~100.00%。不同市州血片制作、染色、清洁度合格率差异均有统计学意义（χ2制作=73.109、χ2染色=130.637、χ2清洁度=68.806, P均< 0.05）。见表2。

表2 2020— 2021年湖北省各市（州）疟原虫阴性血涂片质量复核结果 Table 2 Microscopic reexamination results of quality of negative blood slides in all cities (states) of Hubei, 2020-2021
2.4 城市医院和乡镇卫生院阴性血片质量的比较

2020— 2021年共计复核来自乡镇卫生院的阴性血片922张, 城市医院的阴性血片583张。乡镇卫生院制片、染色、清洁度合格率分别为86.66%（799/922）、77.33%（713/922）、82.32%（759/922）, 城市医院制片、染色、清洁度合格率分别为94.17%（549/583）、85.08%（496/583）、89.02%（519/583）, 城市医院与乡镇卫生院制片、染色、清洁度合格率差异均有统计学意义（χ2=21.551、13.561、12.523, P均< 0.05）。

2.5 复核血片质量缺陷分析

血涂片质量缺陷以有沉渣、溶血不全及血膜制作不规范为主。其中血涂片有沉渣比例最高, 占21.30%, 其次为溶血不全13.36%、制作不规范12.27%、染色深浅11.43%、厚血膜脱落10.95%, 见表3。

表3 血涂片复检质量缺陷构成比 Table 3 Composition ratio of quality defects in blood slides
3 讨论

2021年6月30日, 中国正式获得世界卫生组织消除疟疾认证[13], 巩固消除疟疾成果, 防止输入再传播是今后疟疾防控工作的核心[14]。在疟疾消除后阶段, 有效监测和及时发现传染源尤为关键, 显微镜镜检法仍是目前诊断疟原虫的金标准, 合格的血涂片则是确保镜检结果准确的前提和保证, 尤其在不能开展核酸检测的基层医疗机构和镜检站。因此, 保障血涂片质量和提升疟原虫镜检诊断能力则显得尤为重要。

2020— 2021年湖北省疟疾诊断参比实验室共计复核血涂片1 661张, 血涂片质量总体较好, 血片制作、染色和清洁度总合格率分别为88.50%、80.01%和84.71%, 与杭州市复核质量结果基本一致[15], 明显高于云南省、贵州省等地[16, 17], 这得益于我省自2010年启动消除疟疾行动计划以来, 建立逐级督导复核并通报机制, 省级对市级、市级对县级、县级对乡镇逐级开展督查和抽检复核并及时通报反馈结果, 有效地提高了各级医疗机构血涂片制作质量与水平。

阳性血片复核结果显示, 不同年份间阳性血片制作、染色、清洁度的合格率较稳定, 均稍低于每年的阴性血片质量。疟原虫定性符合率为77.78%, 虫种符合率为87.76%, 表明我省各市州精准判定虫种的能力较强, 但在疟原虫定性诊断方面还有待进一步加强。14例定性误检病例中, 9例被诊断为恶性疟, 4例未分型, 1例被诊断为间日疟, 误检原因主要有两个方面：一是检验人员过于依赖快速诊断试剂（RDTs）结果, 而抗原在患者体内长期残存、抗体的非特异性反应均会造成RDTs出现假阳性[18, 19]; 二是经验不足易将血涂片中的杂质、可疑圆点判定为疟原虫环状体。卵形疟和三日疟的误判率较高, 主要因我省曾是间日疟历史流行区, 1964 至2012 年所有本地感染病例均为间日疟, 消除阶段境外输入病例也以恶性疟和间日疟为主, 占87.48%[3], 且省级对基层各地开展的疟原虫镜检培训常以恶性疟、间日疟形态鉴定为主, 导致镜检人员对卵形疟和三日疟病例接触甚少, 未及时得到培训练习, 缺乏判断经验。提示今后培训和督导工作应将疟原虫定性诊断, 卵形疟和三日疟的形态鉴定作为重难点。

阴性血片的镜检符合率为100.0%, 未发现漏检血片, 说明各地疟疾镜检阴性结果可靠性高, 出现病例漏检可能性较小。阴性血片制片、染色、清洁度合格率为89.57%、80.33%、84.92%。不同市州阴性血片制作、染色、清洁度合格率差异较大。质量较好的如武汉市、宜昌市和襄阳市均为我省经济较发达城市, 镜检人员相对固定且近年来输入病例较多。潜江市在制片、染色和清洁度方面合格率均低于80%, 该市自2018年以后无输入性病例[20], 部分医疗卫生机构人员产生麻痹松懈思想, 对发热病人的血检不够重视, 从而影响血片制作质量。提示在今后工作中应重点强化对输入病例数较少且镜检能力较弱、血片质量较差地区的培训和督导。另外, 来源于城市医院的血片质量高于乡镇卫生院, 主要原因可能是城市医院检验人员参加相关培训的次数较多, 因近些年疟疾病例初诊主要集中在县级以上医疗机构[20], 故省级和市级组织的培训大多针对疟疾防治定点医院和报告病例较多的城市医院。另一方面由于城市医院检验岗位职责明确, 人员相对固定, 涉及病种复杂繁多, 有更多机会接触除疟疾外其他病种的血涂片制作, 故更加注重血涂片的制作质量。

综上所述, 湖北省各市州疟疾镜检能力和血片质量总体较好, 但各地之间差异性较大。且随着消除疟疾工作的推进和完成, 医疗机构人员对疟疾认识和重视度逐渐下降, 镜检人员的流失, 导致疟疾的诊断与疫情监测面临新的挑战。今后, 一是需要进一步加强对市、县级疟疾网络诊断实验室建设, 采用多种形式如逐级镜检培训、省市县三级举办寄生虫病防治技术竞赛有针对性地对镜检人员进行培训和复训。二是继续加强发热病人血检督导和考核工作, 持续加大对各地医疗机构的疟疾风险评估和血涂片盲样考核的抽检范围和力度, 并逐步形成疟疾血片质量控制评价体系, 切实提高血检质量和镜检能力, 确保消除后有效敏感的监测, 巩固消除疟疾成果。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：陈景丽 谢永慧

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