引用本文
柳晓金, 张珣, 李曼, 王玉清, 郑立恒. 脑脊液抗酸瑞吉双重染色法的建立与评价[J]. 中国热带医学, 2022,22(4): 335-338.
LIU Xiao-jin, ZHANG Xun, LI Man, WANG Yu-qing, ZHENG Li-heng. Establishment and evaluation of acid fast-Wright's double staining in cerebrospinal fluid[J]. China Tropical Medicine, 2022,22(4): 335-338.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.04.09
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脑脊液抗酸瑞吉双重染色法的建立与评价
柳晓金1, 张珣1, 李曼1, 王玉清2, 郑立恒1,*
1.河北省胸科医院,河北 石家庄 050041
2.青海省第四人民医院,青海 西宁 810000
*通信作者：郑立恒,E-mail：zhengliheng2006@163.com

作者简介：柳晓金（1983—）,女,硕士,副主任医师,研究方向：感染性疾病的诊治。

收稿日期: 2022-01-18
基金资助: 青海省基础研究计划（No. 2018-ZJ-743）
摘要

目的 建立脑脊液抗酸瑞吉双重染色法,并评价其诊断结核性脑膜炎的价值。方法 建立抗酸瑞吉双重染色法：脑脊液用吸管轻轻吹打混匀,取0.5 mL加入Cytospin-4型甩片机中,采用28× g离心5 min;待玻片干燥后,滴加碱性复红溶液（碱性复红8 g溶于10 mL乙醇中,加5%石碳酸900 mL,放置24 h后过滤备用）,染色10 min;再用5%盐酸-75%乙醇脱色1 min;然后滴加瑞氏吉姆萨A液约0.5 mL到涂片上,最后将B液加于A液上面,使A、B染液充分混匀,染色5 min;水洗、干燥、镜检。选取河北省胸科医院2018年10月—2019年10月高度疑似结核性脑膜炎的患者48例,采集治疗前脑脊液分别进行抗酸瑞吉双重染色、离心涂片抗酸染色和改良抗酸染色,以临床诊断为金标准,计算3种方法在结核性脑膜炎诊断中的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率、 Kappa值。结果 抗酸瑞吉双重染色的灵敏度为81.25%,特异度为100.00%,阳性预测值为100.00%,阴性预测值为72.73%,一致率为87.50%, Kappa值为0.74;离心涂片抗酸染色的灵敏度为6.25%,特异度为100.00%,阳性预测值为100.00%,阴性预测值34.78%,一致率为37.50%, Kappa值为0.04;改良抗酸染色的灵敏度为87.50%,特异度为100.00%,阳性预测值为100.00%,阴性预测值为80.00%,一致率为91.67%, Kappa值为0.82。结论 抗酸瑞吉双重染色对结核性脑膜炎诊断的灵敏度、特异度均高,可以节省标本,提高诊断效率,值得推广应用。

关键词: 结核性脑膜炎; 脑脊液; 改良抗酸染色; 瑞吉染色; 双重染色
中图分类号:R529.3 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)04-335-04
Establishment and evaluation of acid fast-Wright's double staining in cerebrospinal fluid
LIU Xiao-jin1, ZHANG Xun1, LI Man1, WANG Yu-qing2, ZHENG Li-heng1
1. Hebei Chest Hospital, Shijiazhuang, Hebei 050041, China
2. The Fourth People's Hospital of Qinghai Province, Xining, Qinghai 810000, China
Corresponding author: ZHENG Li-heng, E-mail: zhengliheng2006@163.com
Abstract

Objective To establish a method of acid fast-Wright's double staining and evaluate its diagnostic value in tuberculous meningitis.Methods Establishment of acid fast-Wright's double staining: 0.5 mL of CSF specimens were loaded into the chamber in which poly-L-lysine-coated slides were inserted and centrifuged at 28× gfor 5 minutes. After the chamber were removed and the slides were dried, basic fuchsin solution (8 g of basic fuchsin was dissolved in 10 mL of ethanol, after which 900 mL of 5% carbolic acid was added and mixed, 24 hours later, the mixture was filtered for use) was dropped onto the slides and standed for 10 minutes, then decolorized with 5% hydrochloric acid-75% ethanol for 1 minutes, finally, 0.5 mL of Wright Giemsa solution A and solution B was added successively and fully mixed on the slides, 5 minutes later, washed the mixed solution and dried the slides before microscopy. 48 patients in Hebei Chest Hospital from October 2018 to October 2019 were included in the analysis. The cerebrospinal fluid were collected and detected by acid fast-Wright's double staining, anti-acid staining and modified Ziehl-Neelsen stain. Clinical diagnosis as the gold standard and sensitivity, specific, positive and negative predictive value, concordance rate and the Kappa value of the three methods were calculated.Results The sensitivity of acid fast-Wright's double staining was 81.25%, specificity 100.00%, positive predictive value 100.00%, negative predictive value 72.73%, concordance rate 87.50%, and the Kappa value 0.74. The sensitivity, specificity, positive predictive value, and the negative predictive value of anti-acid staining were 6.25%, 100.00%, 100.00% and 34.78%, respectively, the concordance rate 37.50%, and the Kappa value 0.04. The sensitivity of modified Ziehl-Neelsen stain was 87.50%, specificity 100.00%, positive predictive value 100.00%, negative predictive value 80.00%, the concordance rate 91.67%, and the Kappa value 0.82.Conclusions The acid fast-Wright's double staining has high diagnostic value for the tuberculous meningitis, and also helps to save enough samples for other tests. It is worthy of widespread promotion in the laboratories.

Keyword: Tuberculous meningitis; cerebrospinal fluid; modified Ziehl-Neelsen stain; Wright's stain; double staining

结核性脑膜炎（tuberculous meningitis, TBM）是一种非常严重的肺外结核病, 病死率达13%~72%, 致残率约20%~30% [1, 2], 早期误诊、误治情况多见, 常因延误治疗而导致病情加重, 早诊断、早治疗可明显改善预后[3, 4]。TBM诊断金标准是脑脊液抗酸染色阳性或结核分枝杆菌培养阳性, 但是传统的离心涂片抗酸染色阳性率极低, 结核菌培养因耗时长不能做到及时诊断。近年的改良抗酸染色明显提高了阳性率[5], 对TBM的早期诊断有重要价值。随着检测项目的不断增多, 所需要的脑脊液的量也在不断攀升, 但是每次腰穿所取的脑脊液量是有限的。本课题组在探索脑脊液抗酸瑞吉双重染色这种新的技术方面取得了新的进展, 只需要0.5 mL脑脊液, 就可以同时完成脑脊液抗酸染色和细胞学两项检查, 还可以观察到白细胞吞噬结核分枝杆菌的现象, 评估免疫反应状态。通过对河北省胸科医院收治的48例高度疑诊TBM患者的脑脊液分别进行离心涂片抗酸染色、改良抗酸染色和抗酸瑞吉双重染色, 以临床诊断为金标准, 评价抗酸瑞吉双重染色在TBM诊断的敏感度和特异度, 探讨其应用价值。

1 对象与方法
1.1 研究对象

将2018年10月— 2019年10月于河北省胸科医院就诊的临床高度疑似TBM非HIV感染的患者48例纳入, 年龄范围19~64岁, 平均年龄（33.56±5.68）岁; 其中男性30例, 女性18例。对所有患者脑脊液进行常规、生化、腺苷脱氨酶（ADA）检查。本研究得到本院伦理委员会批准。

1.2 纳入标准

①年龄> 18周岁; ②临床高度怀疑TBM, 符合诊断标准[6], 有结核病接触史或脑外结核病史, 发病缓慢或亚急性, 有发热、颅内高压、脑膜刺激征, 脑脊液检查排除细菌、真菌、病毒等病原引起的颅内感染; ③脑脊液白细胞（200~1 000）× 106/L, 多核> 50%, 糖、氯化物降低和蛋白升高; ④影像学符合结核性脑膜炎特征; ⑤签署知情同意书。

1.3 仪器与试剂

二级生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）, 抗酸染液（珠海贝索生物技术有限公司）, 瑞吉染液（珠海贝索生物技术有限公司）, 显微镜（LEICA）, Cytospin-4型甩片机（Thermo）。

1.4 研究方法

1.4.1 标本留取 患者入院后治疗前在无菌操作下行腰椎穿刺术, 留取脑脊液5 mL分别行抗酸瑞吉双重染色、离心涂片抗酸染色、改良抗酸染色进行检测。

1.4.2 方法 （1）抗酸瑞吉双重染色：脑脊液用吸管轻轻吹打混匀, 取0.5 mL加入Cytospin-4型甩片机中, 采用28× g离心5 min。染色：①碱性复红8 g溶于10 mL乙醇中, 加5%石碳酸900 mL, 放置24 h后过滤备用, 染色10 min; ②5%盐酸-75%乙醇脱色1 min; ③滴加瑞氏吉姆萨A液约0.5 mL到涂片上; ④再将B液加于A液上面（滴加量为A液的2~3倍）, 使A、B染液充分混匀, 染色5 min; ⑤水洗, 干燥、镜检。

（2）离心涂片抗酸染色检测：将脑脊液2~4 mL加入至一次性离心管中, 采用1 360× g离心10 min, 吸取上清液弃掉, 反复吹打离心管底部沉渣进行涂片, 然后按照《结核病诊断实验室检验规程》[7]进行抗酸染色及镜检。

（3）改良抗酸染色：脑脊液混匀, 取0.5 mL加入Cytospin-4型甩片机中, 采用28× g离心5 min; 取出玻片, 待自然干燥后进行抗酸染色及镜检。

1.5 统计学分析

用SPSS 20.0软件进行统计分析, 计算3种方法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率和Kappa值; 3种方法之间采用配对χ2检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 脑脊液3种方法检测查找抗酸菌结果

将48例患者的脑脊液分别行抗酸瑞吉双重染色、离心涂片抗酸染色和改良抗酸染色检测（图1）, 阳性结果分别为26例（54.17%）、2例（4.17%）、28例（58.33%）（表1）。

图1 3种方法检测脑脊液结核分枝杆菌的结果对比
A、B. 抗酸瑞吉双重染色; C. 改良抗酸染色; D. 离心涂片抗酸染色。箭头所指为结核分枝杆菌。Fig. 1 Comparison of three different methods used to detect the Mycobacterium tuberculosis in cerebrospinal fluid (×1 000)
A and B. acid fast– Wright′s double staining; C. modified Ziehl-Neelsen stain; D. anti-acid staining. The arrow indicates Mycobacterium tuberculosis.

表1 临床诊断结果与3种方法检测脑脊液结核分枝杆菌比较 Table 1 Comparison of the results between clinical diagnosis and the three methods for detection of Mycobacterium tuberculosisin cerebrospinal fluid
2.2 以临床诊断为标准

3种方法诊断的价值及统计学指标 抗酸瑞吉双重染色法的灵敏度为81.25%, 特异度为100.00%, 阳性预测值为100.00%, 阴性预测值为72.73%, 一致率为87.50%, Kappa值为0.74; 离心涂片抗酸染色法的灵敏度为6.25%, 特异度为100.00%, 阳性预测值为100.00%, 阴性预测值为34.78%, 一致率为37.50%, Kappa值为0.04; 改良抗酸染色法的灵敏度为87.50%, 特异度为100.00%, 阳性预测值为100.00%, 阴性预测值为80.00%, 一致率为91.67%, Kappa值为0.82。抗酸瑞吉双重染色法及改良抗酸染色法灵敏度差异无统计学意义（χ2=40.52, P> 0.05）, 均高于离心涂片抗酸染色法（χ2值分别为1.76及1.49, P值均小于0.05）。

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的严重影响人类健康的慢性传染病[8], 随着耐药结核分枝杆菌的流行、免疫抑制剂的应用和艾滋病人的增加, 结核病发病率明显上升, TBM也逐年增多[9– 10], WHO报道2018年有150万人死于此病[11]。TBM是最严重肺外结核病, 每年全世界估计有10多万新病例出现, 其致残率、病死率高[12, 13]。随着结核分枝杆菌耐药性增强, 难治性TBM患者数量不断增加[14], 面对如此严峻的挑战, 及时确诊的情况却并不乐观, 因为TBM的临床症状不典型, 脑脊液菌的浓度很低, 早期病原学诊断困难, 延误治疗会导致预后较差。有文献报道, 早期及时确诊TBM患者的病死率低于10％, 而由于延误诊断的患者的病死率高达60％以上[15]。提高医务人员及时诊治的能力至关重要, 这样才能改善预后。

TBM诊断的金标准是脑脊液抗酸染色阳性或结核分枝杆菌培养阳性, 但传统的离心涂片抗酸染色的阳性率极低, 培养耗费时间较长, 通常要2周以上, 且阳性率仅20%~30%[16], 不能做到及时诊断。2012年, FENG等[17]发表的脑脊液改良抗酸染色使得阳性率提高了将近80%（提供第17篇参考文献引用部分的截图）, 本课题组在其基础上继续优化, 半小时就可得到结果[5]。近年来出现了多种分子诊断技术, Xpert MTB/RIF检测试剂盒、TB-DNA、环介导等温扩增技术和二代测序等, 在不同程度上具有重要的辅助诊断价值, 但是价格普遍较高, 基层也难以完全普及, 免疫学方法SPOT.TB特异度不高。随着检测项目的增多, 脑脊液标本的总需求量也在增加, 但是其不能像其他标本一样大量采集, 甚至出现由于脑脊液采集量不够, 只能选择性的送检某些项目。因此, 快速、准确、特异度高、标本量需求少的脑脊液诊断技术亟需开发研究。

脑脊液传统离心涂片抗酸染色需要5 mL以上的标本用于离心涂片, 改良抗酸染色只需要0.5 mL, 且阳性率亦明显提高, 脑脊液细胞学也只需要0.5 mL的标本量, 所得到的结果可以详细评估脑脊液的免疫反应状态, 后2项技术在TBM的诊断和治疗效果的动态评估方面发挥着至关重要的作用。脑脊液抗酸瑞吉双重染色把2种技术综合到一起, 只需要0.5 mL的标本, 把所需标本量压缩到最低, 其结果既可以看到抗酸菌, 又可以得到细胞学分类和发现白细胞吞噬抗酸菌的现象, 一般40 min就可以得到结果。

本研究对高度疑似TBM并且脑脊液白细胞以多个核细胞为主的脑脊液进行抗酸瑞吉双重染色将其结果与离心涂片抗酸染色和改良抗酸染色结果比较, 以评价新技术在TBM早期诊断中的价值。结果48例患者的脑脊液抗酸瑞吉双重染色、离心涂片抗酸染色和改良抗酸染色的阳性分别为26例（54.17%）、2例（4.17%）、28例（58.33%）, 灵敏度分别为81.25%、6.25%、87.50%, 特异度均为100.00%。抗酸瑞吉双重染色和改良抗酸染色灵敏度明显高于离心涂片抗酸染色（P< 0.05）, 改良抗酸染色灵敏度较双重染色稍高, 但是差异没有统计学意义（P> 0.05）, 二者诊断效能相似, 两种技术所需时间只差几分钟, 双重染色进一步减少了标本的用量, 灵敏度、特异度均较高, 费用低, 但也有其不可避免的缺陷, 改良抗酸染色由于第三液是蓝色, 可以和抗酸菌的红色形成鲜明的对比, 较易辨认, 而双重染色背景偏红, 需要更加认真的观察辨别能力, 但是经过训练都可以达到预期效果。

综上, 双重染色法灵敏度高, 快速、经济、节省标本、设备简单、操作方便, 肉眼即可判断结果, 在TBM的早期诊断方面有很好的应用价值, 值得临床推广使用。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：陈景丽 谢永慧

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