引用本文
陈健, 魏晓雅, 李婷婷, 殷波, 刘德星, 邱德义, 岳巧云. DNA条形码技术在人体排出未知昆虫幼虫鉴定中的应用[J]. 中国热带医学, 2022,22(4): 339-343.
CHEN Jian, WEI Xiao-ya, LI Ting-ting, YIN Bo, LIU De-xing, QIU De-yi, YUE Qiao-yun. DNA barcoding identification of unknown insect larvae discharged from the human body[J]. China Tropical Medicine, 2022,22(4): 339-343.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.04.10
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DNA条形码技术在人体排出未知昆虫幼虫鉴定中的应用
陈健1,2, 魏晓雅1, 李婷婷1, 殷波3, 刘德星1, 邱德义1, 岳巧云4,*
1.中山海关技术中心,广东 中山 528403
2.珠海国际旅行卫生保健中心（拱北海关口岸门诊部）,广东 珠海 519020
3.湖南省儿童医院,湖南 长沙 410007
4.中山火炬职业技术学院,广东 中山 528436
*通讯作者: 岳巧云, E-mail: 779721036@qq.com

作者简介：陈健（1987—）,男,硕士,工程师,研究方向:分子生物学。

收稿日期: 2021-12-14
基金资助: 海关总署科研项目（No.2020HK121,No.2021HK144）; 中山市重大公益类项目（No.2021B2009）
摘要

目的 使用DNA条形码鉴定方法对两名儿童从尿道排出的不明昆虫幼虫进行鉴定,解决未知昆虫幼虫无法利用传统形态学鉴定方法进行鉴定的难题,为主诊医生后期制定针对性治疗方案提供科学依据。方法 以家长收集并送检的患儿从尿道排出的不明活体昆虫幼虫为材料,先进行图像采集和形态学描述,然后取部分昆虫幼虫组织提取基因组DNA,利用多细胞无脊椎动物线粒体细胞色素氧化酶I（COI）的通用引物进行DNA扩增,PCR产物直接从两端测序,DNA测序结果以MEGA6软件验证图谱确定为有效序列后,经拼接、去除通用引物序列,最终得到658 bp 的COI基因片段碱基序列。上传数据与GenBank和BOLD数据库 中的序列进行同源性比对,建立系统发育树。结果 序列测定结果与GenBank和BOLD中公布的白斑蛾蚋（ Clogmia albipunctata）的 COI序列相似性为100%。选取GenBank 中与目的片段核苷酸序列比较所得相似性较高的7种物种序列,以红头丽蝇为外群,构建NJ树,发现昆虫幼虫的序列以及GenBank中的白斑蛾蚋聚为一类,毛蠓科的全部物种聚成一支,置信度高达100%。结论 根据实验结果可以判断这两名儿童从尿道排出的不明昆虫活虫为白斑蛾蚋的幼虫。DNA条形码技术不仅可以快速准确识别物种种类,还能鉴定近缘种,发现隐存分类单元,是对非成虫发育形态昆虫的快速、准确的种类鉴定方法,可以有效弥补形态学鉴定方法的不足。

关键词: DNA条形码; 未知昆虫幼虫; 泌尿生殖道; 毛蠓幼虫
中图分类号:R115 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)04-339-05
DNA barcoding identification of unknown insect larvae discharged from the human body
CHEN Jian1,2, WEI Xiao-ya1, LI Ting-ting1, YIN Bo3, LIU De-xing1, QIU De-yi1, YUE Qiao-yun4
1. Zhongshan Customs Technology Center, Zhongshan, Guangdong 528403, China
2. Zhuhai International Travel healthcare center, Zhuhai, Guangdong 519020, China
3. Hunan Children's Hospital, Changsha, Hunan 410007, China
4. Zhongshan Torch Polytechnic, Zhongshan, Guangdong 528436, China
Corresponding author: YUE Qiaoyun, E-mail: 779721036@qq.com
Abstract

Objective DNA barcoding techniques were utilized to identify the unknown insect larvae discharged from the urethra from two children, solve the problem that unknown insect cannot be identified by traditional morphological identification methods, and provided a scientific basis for the doctors to draw up a targeted subsequent therapeutic plan.Methods Materials using the unknown insects that discharged with urethra from two children collected by parents , after image acquisition and morphological description, genomic DNA was extracted from part of the insect larvae tissues. Target fragments were amplified with the universal primers of the invertebrate mitochondrial cytochrome oxidase I (COI). The PCR products were directly sequenced from both ends. The DNA sequencing results were verified by MEGA6 software, splice the valid sequence and remove the primer fragments , and then a base sequence of 658 bp COI gene fragment was obtained. Sequences were blasted in the GenBank and BOLD to establish a phylogenetic tree.Results Sequence of the COI fragment from the unknown insect were 100% similar to the sequence of Clommia albipunctata published in GenBank and BOLD. Select the sequences of 7 species with high similarity obtained by comparing the nucleotide sequences of the target fragments in GenBank, and construct the NJ tree with the red-headed blowfly as the outgroup control. Results indicated that the sequence of the unknown insect and the Clommia albipunctata in GenBank were grouped into one group, with a confidence level of 100%, and all species of the Clogmia Genus are grouped into one group.Conclusion According to the results, the unknown insect larvae can be judged to be Clommia albipunctata. The DNA barcoding technique not only can be used to identify species quickly and accurately, but also to identify the closely related species and discover cryptic taxa,which is an accurate species identification method for identifying non-adult morphological insects, which can make up for the lack of morphological identification.

Keyword: DNA barcode; unknown insect larva; urogenital tract; Clogmia albipunctata larva

尿道排虫的病例并不多见, 有文献报道有排出蝇蛆、肾膨结线虫、毛蠓幼虫等[1, 2, 3, 4], 随着卫生环境和意识的提高, 近来年少有相关病例报道。人体的蝇蛆病是由双翅目昆虫幼虫感染人体所致的疾病[5]。由于尿道排出的昆虫为幼虫, 通过形态学观察无法准确进行种类鉴定。湖南某地某家庭的两名儿童自2020年7月起排尿时会不时排出不明昆虫幼虫多只（患儿家长自述）, 送至国内多家著名医院均无法完成准确鉴定。

DNA条形码技术是利用生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段来进行物种快速准确鉴定的技术[6, 7]。传统昆虫形态学鉴定方法无法鉴定亲缘关系接近的昆虫、部分雌虫、非成虫和肢体残缺的昆虫等, DNA条形码鉴定技术解决了这些难题[8, 9]。本文利用DNA条形码标准基因（线粒体COI基因片段）作为分子标记, 对从儿童尿道排出的不明昆虫幼虫进行鉴定。

1 对象与方法
1.1 对象

1.1.1 病例1 患儿, 性别女, 年龄9岁, 因发现尿中有黑色幼虫3 d于2020年9月11日入湖南省儿童医院。患儿父亲口述2020年8月6日患儿下河游泳, 9月8日患儿小便时发现排出2只7~8 mm左右黑色幼虫, 未留取到标本, 患儿无尿频、尿急, 自述排尿时有轻微刺激痛, 无发热, 无肉眼血尿, 自行在家观察尿液情况, 每日留取24 h尿观察。门诊以“ 泌尿道蚊虫幼虫寄生?” 收入。入院时患儿无发热, 无尿频、尿急等不适, 精神食欲睡眠均可, 大便正常。

体查：腹部平软, 无压痛反跳痛, 肝脾未扪及肿大, 双肾区无隆起, 无压痛, 无叩痛, 输尿管行程区无压痛, 膀胱区无压痛。女性外阴, 尿道口阴道口未见明显异常, 肛周未见异常。

检验结果：血常规、大小便常规、肝肾功能、电解质、凝血功能均正常。

入院后, 完善相关检查, 于2020年9月16日行输尿管镜膀胱尿道镜检+阴道镜检, 术中见膀胱粘膜稍充血, 三角区明显, 膀胱及尿道内均未见明显虫体、虫卵或其他异物。阴道皱襞粘膜上少许絮状物。患儿于2020年9月18日出院。

1.1.2 病例2 患儿, 性别男, 年龄6岁11个月, 因发现尿中有黑色幼虫1个月余于2020年9月11日入湖南省儿童医院。患儿父亲口述2020年8月6日患儿下河游泳, 8月27日发现患儿尿中有两只大小约6~9 mm左右黑色幼虫, 8月28日再次排出1只类似幼虫, 患儿无尿频、尿急, 排虫时有轻微刺激痛, 无发热, 无肉眼血尿, 未留取到幼虫标本, 8月29日至南华大学附属第二医院就诊, 查尿常规示“ 白细胞稍高” , 予以“ 头孢类抗生素及肠虫清” 口服3 d, 建议继续观察尿液情况, 每日留取24 h尿观察。9月8日, 患儿再次排出类似幼虫3只, 留取到1只幼虫, 送至南华大学附属第二医院检验科会诊, 门诊以“ 泌尿道蚊虫幼虫寄生?” 收入, 考虑为“ 蚊虫幼虫可能性大” , 建议上级医院就诊。入院时患儿无发热, 无尿频、尿急等不适, 精神食欲睡眠均可, 大便正常。

查体：腹部平软, 无压痛反跳痛, 肝脾未扪及肿大, 双肾区无隆起, 无压痛, 无叩痛, 输尿管行程区无压痛, 膀胱区无压痛, 男性外阴, 包皮不能外翻, 尿道口未见异常。肛周未见异常。

检验结果：血常规、大小便常规、肝肾功能、电解质、凝血功能均正常。

入院后, 完善相关检查, 于2020年9月16日行输尿管镜膀胱尿道镜检术, 术中见后尿道粘膜充血明显。膀胱及尿道内均未见明显虫体、虫卵或其他异物。患儿于2020年9月18日出院。

两儿童出院后, 2020年11月均又发现尿中黑色幼虫, 家长将幼虫送至中山海关技术中心检测。

1.2 研究材料

2020年12月10日病人家属送达的2条不明昆虫幼虫。

1.3 研究方法

1.3.1 昆虫基因组DNA的提取 取昆虫幼虫部分组织, 利用Tiangen公司的血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒提取DNA。

1.3.2 PCR 扩增、测序和分析 DNA的扩增和PCR产物的纯化按照Yue等[10, 11]方法, 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成, EX-Taq DNA 聚合酶、dNTP等PCR试剂从宝生物工程（大连）有限公司购置。使用引物为：LCO1490 5'-GGTCAACAAATCAT AAAGATATTGG-3'; HCO2198 5'-TAAACTTCAGGG TGACCAAAAAATCA-3'[10]。

2 结果
2.1 主要形态特征描述

幼虫体长约9~11 mm。背面黄褐色至深褐色, 腹面淡黄色至乳白色; 头部、背板和呼吸管的前缘和侧缘的颜色更暗。除头部外, 共有11节体节, 具26块背板, 背面和侧面密被向后的淡黄色刚毛, 头适中呈三角形, 具一微小的触角和一咀嚼式口器。除第一腹节有两个环和第八腹节不具环外, 其他腹节又细分为3个环。前气门位于前胸节中段。呼吸管呈锥形, 长为宽的3~4倍; 末端具突起, 腹面的突起比背面的突起长, 侧面的突起又比背面的突起稍长, 每个突起都具长毛, 肛腹突毛稍微长于肛背突, 见图1。

图1 未知昆虫幼虫Fig. 1 Unknown insect larva

2.2 序列比对分析

DNA测序结果经MEGA6软件[12]验证图谱为有效序列。去掉两端的引物得到全长有效序列为658 bp。所测序列在NCBI和BOLD中进行比对。Blast结果表明, 测出的序列与GenBank中编号MF059288公布的白斑蛾蚋的COI序列相似性为99.85%; 在BOLD中的比对结果显示与白斑蛾蚋的相似性为100%, 见图2。将测得的序列上传至GenBank, 登录号为MZ960182。

图2 在BOLD中的比对结果Fig. 2 Blasted results in BOLD

2.3 NJ树的构建与分析

选取GenBank 中与目的片段核苷酸序列比较所得相似性较高的7种物种序列, 以红头丽蝇为外群, 见表1; 用MEGA6构建NJ树, 结果显示（图3）, 本研究中昆虫幼虫的序列以及GenBank中的白斑蛾蚋聚为一类, 置信度高达100%, 毛蠓科的全部物种聚成一支, 红头丽蝇单独为一支, 遗传距离差别明显。因此可以根据所选取的COI序列判断此次所鉴定的未知昆虫幼虫为白斑蛾蚋。

表1 样本及所引用数据信息 Table 1 Accession numbers of the intercepted and reference specimens in GenBank database

图3 基于DNA条形码序列构建NJ系统发育树Fig. 3 Neighbor-joing tree based on DNA barcodes

3 讨论

白斑蛾蚋属双翅目长焦亚目蛾蚋科（毛蠓科）, 毛蠓是微小型多毛或鳞毛的昆虫, 是重要的卫生害虫。毛蠓孳生地十分广泛, 在各类浅小的水体, 如水坑、溪流、水渠、湿泥以及较大水体中的藻丛和植丛边都可以找到毛蠓的幼虫。也是浴室常见的滋扰性害虫, 孽生于浴缸、洗手盘、下水道等处[13, 14]。幼虫或卵意外进入宿主体内, 也能利用宿主的组织来完成生活史。国内有寄生在泌尿系统、鼻腔、口腔、粪便中的报道[15, 16, 17, 18, 19, 20, 21]。据家长口述, 两个儿童均有野外静水接触史, 曾在水坑中玩耍, 猜测为玩耍过程中幼虫侵入泌尿系统。

以往的文献报道仅对感染患者排出的毛蠓幼虫进行了简单的形态学分类鉴定, 都只鉴定到毛蠓科, 无法再进行细致的种类鉴定, 这对制定行之有效的治疗方案不利。昆虫的鉴定一般以成虫的形态特征为依据, 而幼虫的鉴定一直是一个分类难题。采取的措施往往为实验室内饲养, 待幼虫发育成成虫后, 再行鉴定, 费时费力[22]。而体内排出的毛蠓幼虫很快会死亡, 无法饲养成成虫进行鉴定。由于生物的不同组织都储存着相同的遗传信息, 不因生长发育阶段和状态发生变化, DNA条形码是利用基因组DNA上一段标准的基因片段, 经常作为分子靶标来进行种级水平的物种鉴定。因此, 利用DNA条形码鉴定技术可以实现对昆虫的卵、幼虫和蛹等非成虫虫态、雌虫以及肢体残缺不全的物种的鉴定[9, 22, 23]。

在昆虫分类学发展史中, DNA条形码是自林奈双名法以来最为突出的变革, 不仅促进了昆虫分类学和物种多样性研究进程的发展, 而且对种群生态学、物种遗传学和个体分子系统发育等交叉学科的研究也起到积极的助推作用[8]。DNA条形码作为一个重要的分类学方法, 已有40个国家的130多个研究单位参与建立了生物条形码协会（Consortium for the Barcode of Life）, 并建成了一个专业的DNA条形码数据库-BOLD（BARCODE OF LIFE DATA SYSTEM, http://www.barcodinglife.org）, 截至2022 年1 月, BOLD数据库记录了超过1 000 万条DNA条形码序列, 330种物种的DNA条形码信息。庞大的数据库为DNA条形码鉴定技术提供了物种鉴定的基础。相比较与分子指纹等分子鉴定技术, DNA条形码技术不仅可以快速准确识别物种种类, 还能鉴定近缘种, 发现隐存分类单元[24]。

随着测序技术的更新和大数据时代海量数据的产生, 通过构建包含所有发现物种DNA 信息的条形码序列数据库, DNA条形码技术鉴定成本低、速度快、结果精确, 必将成为生物分类学最实效的技术手段、直接的信息资源及鉴定依据。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：王佳燕

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