引用本文
杨艳华, 陈佳仪, 陈妍, 周富华, 林华华, 林颖, 肖光文. 阴道白念珠菌毒力因子表达水平及与耐药的相关性[J]. 中国热带医学, 2022,22(5): 423-428.
YANG Yan-hua, CHEN Jia-yi, CHEN Yan, ZHOU Fu-hua, LIN Hua-hua, LIN Ying, XIAO Guang-wen. Expression level of virulence factors of vaginal Candida albicans and its correlation with drug resistance [J]. China Tropical Medicine, 2022,22(5): 423-428.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.05.06
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阴道白念珠菌毒力因子表达水平及与耐药的相关性
杨艳华1, 陈佳仪2, 陈妍2, 周富华2, 林华华2, 林颖2, 肖光文2,*
1.嘉应学院医学院附属医院,广东 梅州 514031
2.嘉应学院医学院基础部,广东 梅州 514031
*通信作者：肖光文,E-mail: 15916547823 @163.com;

作者简介：杨艳华（1979—）,女,硕士,副主任医师,研究方向：妇科相关疾病的研究。

收稿日期: 2021-09-18
基金资助: 广东省教育科研“十三五”规划课题（No. 2018GXJK178）; 嘉应学院大学生创新创业训练计划项目（No. S202010582089）
摘要

目的 了解复发性念珠菌性阴道炎（RVVC）患者与阴道白念珠菌定植者的阴道白念珠菌的生物膜、水解酶和菌丝壁蛋白1（ HWP1）基因等毒力因子的体外表达水平及其耐药性,初步探究白念珠菌致病性和耐药性与毒力因子之间的关系,为进一步探明白念珠菌引起的RVVC的致病和耐药机制提供资料。方法 前瞻性收集分离来源于成年女性RVVC患者和阴道白念珠菌定植者的100株阴道白念珠菌,采用酵母样真菌药物敏感性试剂盒检测对5种常用抗真菌药物的敏感性,采用结晶紫染色法检测其生物膜形成能力,采用牛血清白蛋白平板、卵黄琼脂平板和三丁酸甘油脂平板检测阴道白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）、磷脂酶（PL）和脂肪酶（Lip）的活性,采用实时荧光PCR检测 HWP1基因的表达。结果 5种常用抗真菌药物中至少1种耐药的白念珠菌RVVC患者来源有13株,阴道定植者来源有10株;RVVC患者来源菌株的生物膜、3种分泌型水解酶和 HWP1基因体外表达水平均高于阴道定植者来源菌株（均 P<0.05）,两组在生物膜形成强弱、3种水解酶表达高低等定性角度,差异均有统计学意义（均 P<0.05）;耐药性菌株生物膜表达水平高于非耐药性菌株外（ P<0.05）,对3种分泌型水解酶和 HWP1基因体外表达水平上两组间没有差异（均 P>0.05）;Pearson相关性分析结果显示,除 HWP1基因和生物膜-OD之间呈弱相关性（ r=0.211, P=0.039）外,其他各项指标之间没有相关性（均| r|<0.2, P>0.05）。结论 白念珠菌的毒力因子生物膜、SAP、 PL、Lip和HWP1都可能在RVVC的致病过程中发挥了重要作用,HWP1与生物膜的形成呈弱相关性,生物膜的形成与阴道白念珠菌的耐药性产生可能存在关联。

关键词: 复发性念珠菌性阴道炎; 生物膜; 菌丝壁蛋白1基因; 水解酶
中图分类号:R561 文献标志码:A 文章编号:11009-9727(2022)05-423-06
Expression level of virulence factors of vaginal Candida albicans and its correlation with drug resistance
YANG Yan-hua1, CHEN Jia-yi2, CHEN Yan2, ZHOU Fu-hua2, LIN Hua-hua2, LIN Ying2, XIAO Guang-wen2
1. Affiliated Hospital of Medical College of Jiaying University, Meizhou, Guangdong 514031, China
2. Basic Department of Medical College of Jiaying University, Meizhou, Guangdong 514031, China
Corresponding author: XIAO Guang-wen, E-mail: 15916547823@163.com
Abstract

Objective To understand resistance and in vitro expression levels of virulence factors such as biofilm, hydrolytic enzyme and hyphal wall protein1 ( HWP1) gene of Candida albicans in patients with recurrent vulvovaginal candidiasis (RVVC) and vaginal Candida albicanscolonizer. The preliminary exploration of the relationship between the pathogenicity and drug resistance of Candida albicansand provide information for further understanding of the pathogenicity and drug resistance mechanism of RVVC caused by Candida were explored.Methods Prospective collection of 100 vaginal Candida albicans from adult female RVVC patients and colonizers were conducted, the sensitivity to five commonly used antifungal agents was detected by yeastlike fungal drug sensitivity kit, and the biofilm-forming ability was detected by crystal violet staining,the activities of secreted aspartic protease (SAP), phospholipase (PL) and lipase (LIP) were detected by bovine serum albumin (BSA) plate, yolk AGAR plate and tributyrin plate,the expression of HWP1 gene was detected by real-time fluorescent PCR.Results Among the Candida albicans resistant to at least one of the five commonly used antifungal drugs, 13 strains were from RVVC patients and 10 from vaginal colonizers; the expression levels of biofilm in vitro, three hydrolytic enzyme and HWP1 genes in the strains from RVVC patients were significantly higher than those from vaginal colonization (all P<0.05), there were statistically significant differences between the two groups in terms of the qualitative aspects such as the ability of biofilm formation and the expression level of three hydrolytic enzyme (all P<0.05); the biofilm expression level of drug-resistant strains was significantly higher than that of non-resistant strains ( P<0.05), and there was no significant difference in the in vitro expression levels of the three secreted hydrolases and HWP1 gene between the two groups (all P>0.05); Pearson correlation analysis showed that, except for the weak correlation between HWP1 gene and biofilm-OD (r=0.211, P=0.039), there was no obvious correlation between other indicators (all | r|<0.2 , P>0.05).Conclusions These virulence factors of Candida albicansmay have played an important role in the pathogenesis of RVVC, including biofilm, SAP, PL, Lip and HWP1, there was a weak correlation between HWP1 and the formation of biofilm,the formation may be related to the resistance of vaginal Candida albicans.

Keyword: Recurrent vulvovaginal candidiasis; biofilm; hyphal wall protein 1 gene; hydrolytic enzyme

念珠菌性阴道炎( vulvovaginal candidiasis, VVC）是一种常见的女性生殖道感染性疾病, 在女性的一生之中有70％~75％的概率至少发生一次VVC[1], 同时有多达5％~8％的患者发展成复发性VVC（RVVC）。关于RVVC的病因目前认为这可能和念珠菌物种的致病性因素、机体的免疫反应和遗传因素等密切相关。RVVC对妇女的生活质量造成了严重影响, 目前被认为是导致增加女性发生焦虑和抑郁等的重要影响因素之一[2]。在RVVC病因的念珠菌物种因素里, 念珠菌分泌的诸如脂肪酶（lipase, Lip）、磷脂酶（phospholipase, PL）和分泌型天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartyl proteinase, SAP）等毒力因子是发病机理的关键因素之一[3]。RVVC中白念珠菌常见的几个与菌丝相形成有关的基因主要包括 ALS1、ALS3、ECE1和菌丝壁蛋白1（hyphal wall protein1, HWP1）基因[4], 其中HWP1主要编码一种与细胞壁的组装、细胞内信号传导和通过与细胞壁的葡聚糖交联而产生的菌丝扩展等功能的蛋白[5, 6]。HWP1促进念珠菌与上皮细胞的结合后完成定植, 是全身性念珠菌病的重要致病因素之一[6]。有研究显示HWP1基因的表达水平上, 菌丝相念珠菌细胞明显高于酵母相念珠菌细胞[5], 另有研究[7]表明白念珠菌的菌丝相比其酵母相黏附性和侵袭力均明显增强。另外, 研究表明白念珠菌的菌丝相比酵母相, 与生物被膜的形成关系更密切[7], 而生物被膜是白念珠菌的致病性和耐药性非常重要的影响因素。考虑到不同毒力因子之间可能存在相互某种联系, 本研究通过对分离来源于RVVC患者和定植者白念珠菌毒力因子的体外表达水平进行比较, 并分析各毒力因子表达水平之间的相关性, 同时对耐药株和敏感株相关毒力因子的体外表达水平进行比较, 初步探究白念珠菌致病性和耐药性与毒力因子之间的关系, 为进一步探明白念珠菌引起的RVVC的致病和耐药机制提供资料。

1 对象与方法
1.1 研究对象

前瞻性收集分离来源于成年女性RVVC患者[平均年龄为（35.1± 5.8）岁]和阴道白念珠菌定植者[平均年龄为（33.6± 6.1）岁]的阴道白念珠菌各50株, 两组人群年龄分布之间差异无统计学意义 （t=1.354, P=0.198）。所有RVVC患者在过去的一年中都有3~4次念珠菌感染的病史, 并且在研究时急性发作, 其白带常规检验结果为可以找到酵母样菌菌丝, 其临床症状均存在以下至少两种体征和症状来定义：豆腐渣样白带, 阴道瘙痒, 明显烧灼感和性交困难。纳入研究的患者在研究前一月内均未接受任何抗菌或抗真菌治疗。定植者为过去的2年中没有念珠菌感染的病史并没有使用过抗真菌药物治疗, 无明显临床症状, 白带常规检验结果清洁度Ⅰ ~Ⅱ 度、找到酵母样真菌但不见菌丝, 分泌物经沙保弱琼脂培养基分离培养后能分离到白念珠菌的妇女。

1.2 仪器与试剂

VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统和酵母样真菌药敏试剂盒为法国生物梅里埃公司产品, 7500 Real Time PCR System为美国赛默飞世尔公司产品, Max250多功能酶标仪为美国 Molecular Devices公司产品, 酵母总RNA提取试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq为日本TaKaRa公司产品, NaCl、KH2PO4、 CaCl2 、冰醋酸、甲醇、和无水乙醇购自西安泰华医药科技有限公司, 小牛血清、牛血清白蛋白、蛋白胨和引物购自上海生工生物工程股份有限公司, 结晶紫、50%卵黄乳液、科玛嘉显色平板、沙保弱琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液体培养基、三丁酸甘油酯和三丁酸甘油酯平板琼脂基础等均购自杭州滨和微生物试剂有限公司, 96孔细胞培养板、RPMI-1640培养液和磷酸盐缓冲液等均购自美国康宁公司。标准菌株为白念珠菌（ATCC 90028）和近平滑念珠菌（ATCC 22019）均购自上海复祥生物科技有限公司。

1.3 菌株的分离培养与药敏试验

由妇科医生采集的阴道拭子标本, 接种于科玛嘉念珠菌显色平板经35 ℃ 24~48 h培养, 挑取直径2~3 mm的翠绿色菌落, 经VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统鉴定确定为白念珠菌后保存该菌株备用。抗真菌药物的敏感性试验采用酵母样真菌药物敏感性试剂盒进行检测, 试剂盒包含氟康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶、伏立康唑和伊曲康唑5种临床常用抗真菌药物。

1.4 生物膜形成的检测

将待测菌株在沙保弱琼脂平板上于35 ℃培养1 d, 用接种环挑取白念珠菌单个菌落于5 mL YPD液体培养基中, 于35 ℃、200 r/min振荡培养过夜后混匀, 取上述真菌培养液用RPMI-1640培养液通过麦氏比浊仪调试为1个标准麦氏浊度, 取100 μ L上述菌悬液于96孔聚苯乙烯微量细胞培养板中, 35 ℃震荡培养2 h后弃去孔中培养液, pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次后再次加入100 μ L RPMI-1640培养液, 35 ℃继续培养, 每24 h后磷酸盐缓冲液洗涤3次后更换1次RPMI-1640培养液, 经过两次更换培养后再弃去培养液并用磷酸盐缓冲液洗涤3次, 每孔加入10 μ L甲醇进行15 min的固定, 然后吸弃上清并晾干, 每孔分别用100 μ L 0.5%结晶紫染液染色15 min, 用蒸馏水洗涤3次, 最后每孔分别加入33%醋酸溶液150 μ L , 于620 nm处用Max250多功能酶标仪读取OD值; 以白念珠菌（ATCC 90028）测定结果作为阳性对照, 近平滑念珠菌（ATCC 22019）测定结果作为阴性对照。生物膜阴、阳性的判断标准按照3个空白对照孔OD值的均值的2倍作为判断依据, 生物膜强弱的判断标准以阳性对照孔OD值均值作为判断依据。以所有标本阳性对照孔OD值均值为标准判断生物膜形成能力的强弱, 大于平均OD值的判断为强, 小于平均OD值的判断为弱。每次试验每份样本均做3个复孔, 取平均值为最终结果。

1.5 三种水解酶的检测

根据文献[8]报道的配方分别配置用于筛选SAP的牛血清白蛋白平板、用于筛选PL的卵黄琼脂平板和用于筛选Lip的三丁酸甘油酯平板。取前述1麦氏浊度浓度的真菌菌液, 均取 10 μ L分别点种至牛血清白蛋白平板、卵黄琼脂平板和三丁酸甘油酯平板上预先贴好的直径 6 mm 圆形滤纸片上, 用直径为6 mm的L型棒的钝端于滤纸上涂开, 35 ℃恒温培养箱中, 每隔24 h进行观察, 以白念珠菌（ATCC 90028）平板上菌落周围首先出现明显沉淀圈或透明圈的时间为最佳观察时间, 最终确定牛血清白蛋白平板、卵黄琼脂平板和三丁酸甘油酯平板的最佳培养时间分别为 7、4 和 6 d。其他待测菌均在最佳观察时间观察并记录菌落直径和菌落加圈层的直径按照公式：Pz值=菌落直径/（菌落直径+圈层直径）, 计算总直径。每株菌株均在三种平板上分别重复检测3次, 最终结果取平均值。Pz值越大表明水解酶产生越少。目前一般认为Pz值≤ 0.59为水解酶高表达; Pz值为0.60~0.79, 水解酶中等表达; Pz值为0.80~< 1.00, 水解酶低表达; Pz值=1, 表示不产此水解酶[8]。

1.6 实时荧光定量PCR法检测HWP1的表达

取培养于YPD培养基中的真菌菌液, 细胞裂解液裂解酵母细胞后, 酵母总RNA提取试剂盒提取其RNA, 清洗后, 用RNase-free dH2O溶解提取物于-70 ° C保存。逆转录按照说明书使用PrimeScript RT reagent Kit进行操作, 其反应体系、目的基因HWP1和内参基因18s rRNA的引物设计以及实时荧光定量PCR的反应体系均参照文献[8]报道。HWP1的相对表达量的计算公式为：Δ Ct=Ct(HWP1)-Ct(18s rRNA) 及Value=2-Δ Ct, Ct为根据PCR反应信号强度设立的循环阈值。

1.7 统计学分析

所有数据均采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料采用率（%）表示, 率的比较采用χ 2检验。计量资料以均数± 标准差（x± s）表示, 组间比较采取 t检验。对各毒力因子体外表达量和HWP1基因的表达量之间的关联采用Pearson相关性分析。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 两种来源白念珠菌的药敏试验情况

RVVC患者来源的白念珠菌对5种常用抗真菌药物中至少1种耐药的有13株, 其中11株对1种药物耐药, 2株对2种药物耐药。阴道定植者来源的白念珠菌对5种常用抗真菌药物中至少1种耐药的有10株, 均为对1种药物耐药。两种来源白念珠菌对5种常用抗真菌药物中至少1种耐药的比率差异无统计学意义（χ 2=0.508, P=0.635）。见表1。

表1 两种来源白念珠菌对常见抗真菌药物的耐药情况 Table 1 Resistance of Candida albicans isolated from RVVC patients and vaginal colonizers to common antifungal drugs
2.2 不同来源白念珠菌3种分泌型水解酶、HWP1基因和生物膜形成体外表达水平

结晶紫染色法显示, 100株白念珠菌菌株的生物膜均为阳性, RVVC患者来源菌株生物膜检测OD值高于阴道定植来源菌株, 同时从生物膜形成能力强弱看, RVVC患者来源菌株生物膜形成能力强的菌株(66%), 高于阴道定植者来源菌株（38%)（P< 0.05）; RVVC患者来源菌株3种分泌型水解酶SAP、 PL和Lip的Pz值均低于阴道定植者来源菌株（均P< 0.05）, RVVC患者来源菌株3种分泌型水解酶的表达水平强于阴道定植者来源菌株（均P< 0.05）; RVVC患者来源菌株的HWP1基因体外表达水平高于阴道定植者（P< 0.05）; 见表2和表3。

表2 不同来源白念珠菌生物膜、3种分泌型水解酶和HWP1基因体外表达水平 $\bar{x}$± s Table 2 In vitro expression levels of Candida albicans from different sources on three secreted hydrolases, HWP1 genes and biofilm formation $\bar{x}$± s
表3 不同来源白念珠菌生物膜形成、SAP、 PL和Lip的体外表达水平情况 n(%) Table 3 The expression levels of Candida albicans from different sources on biofilm formation, SAP, PL and Lip n(%)
2.3 不同耐药性白念珠菌3种分泌型水解酶、HWP1基因和生物膜形成体外表达水平

对5种抗真菌药物至少一种耐药的菌株生物膜检测OD值高于对5种抗真菌药物均不耐药菌株（P< 0.05）, 同时从生物膜形成能力强弱看, 两组之间差异无统计学意义（P> 0.05）; 对5种抗真菌药物至少一种耐药的菌株3种分泌型水解酶SAP、 PL和Lip的Pz值与对5种抗真菌药物均不耐药菌株比较差异均无统计学意义（均P> 0.05）, 两组菌株对3种分泌型水解酶的表达水平差异亦无统计学意义（均P> 0.05）; 对5种抗真菌药物中至少一种耐药的菌株的HWP1基因体外表达水平高于对5种抗真菌药物均不耐药菌株, 但差异无统计学意义（P> 0.05）; 见表4和表5。

表4 不同耐药性白念珠菌3种分泌型水解酶、HWP1基因和生物膜形成体外表达水平 $\bar{x}$± s Table 4 In vitro expression levels of three secreted hydrolases, HWP1 genes and biofilm formation by Candida albicanswith different drug resistance $\bar{x}$± s
表5 不同耐药性白念珠菌生物膜形成、SAP、 PL和Lip的体外表达水平情况 n(%) Table 5 The expression levels of different drug-resistant Candida albicans on biofilm formation, SAP, PL and Lip n(%)
2.4 100株阴道分离白念珠菌生物膜、SAP、 PL、Lip和HWP1基因之间的相关性

100株阴道分离白念珠菌生物膜、SAP、 PL、Lip和HWP1基因表达Pearson相关性分析结果显示, 除HWP1基因和生物膜-OD之间呈弱相关性（r=0.211, P=0.039）外, 其他各项指标之间无相关性（均|r|< 0.2, P> 0.05）; 见表6。

表6 100株阴道分离白念珠菌生物膜、SAP、 PL、Lip和HWP1基因表达之间的相关性 r(P) Table 6 Correlation among 100 strains of vaginal Candida albicans biofilm, SAP, PL, Lip and HWP1gene expression r (P)
3 讨论

从研究情况来看, RVVC患者来源白念珠菌生物膜形成能力明显强于阴道定植者来源的白念珠菌, 这与Majumdar等[9]的研究结论是相似的。耐药菌株生物膜检测OD值明显高于非耐药菌株, 表明出现耐药的白念珠菌菌株生物膜形成能力可能强于非耐药菌株, 这与目前白念珠菌耐药性研究的相关成果[10, 11, 12]是相似的。本研究中从白念珠菌生物膜强弱定性角度分析, 耐药的白念珠菌菌株生物膜形成能力强于非耐药菌株, 但没有统计学差异, 其原因可能是我们研究的菌株数量较少有关。真菌的生物膜生态系统比其自由漂浮的浮游细胞更具毒性[13], 生物膜的形成有助于逃避宿主免疫因子的攻击, 从而增加附着和侵入组织, 组织侵入反过来会增强毒力和对药物的抵抗力[7], 这可能是白念珠菌生物膜的形成能力与其致病性和耐药性密切相关的原因。

SAP、 PL和Lip是白念珠菌分泌的水解酶类, 目前被证实是白念珠菌的重要毒力因子, 其中SAP在白念珠菌黏附、浸润上皮细胞并造成的上皮细胞损伤以及免疫逃避等致病机制发挥了重要作用[14], PL有利于白念珠菌的入侵时破坏宿主细胞膜和参与免疫逃避作用[15, 16], 而Lip可通过水解竞争菌和影响宿主免疫以实现自我防御[17]。本研究中RVVC患者来源白念珠菌3种分泌型水解酶SAP、 PL和Lip的Pz值均明显低于阴道定植者来源菌株, 从3种分泌型水解酶强弱的定性角度分析, RVVC患者来源菌株明显强于阴道定植者来源菌株, 表明SAP、 PL和Lip都在RVVC的发病机制中可能发挥了重要的作用。耐药菌株与非耐药菌株3种分泌型水解酶SAP、 PL和Lip无论从定量角度, 还是强弱的定性角度比较均无明显差异, 表明其与阴道白念珠菌的耐药性关系可能不大。

HWP1基因编码的酸性甘露糖蛋白HWP1P属于GP1锚定蛋白, 是白念珠菌菌丝发育和黏附宿主上皮细胞必需的蛋白之一, HWP1不仅可以介导白念珠菌牢固地黏附于宿主细胞表面, 还在白念珠菌生物膜形成过程中起到促进分散的菌体形成微菌落的作用, 是白念珠菌的重要毒力因子[18]。本研究中RVVC患者来源菌株的HWP1基因表达水平明显高于阴道定植者, 进一步证实了HWP1基因可能是RVVC发生过程中一个重要的致病因子之一。在Pearson相关性分析中, 100株白念珠菌HWP1基因表达水平与结晶紫染色法检测生物膜的OD值呈弱相关, 这表明阴道白念珠菌的生物膜形成过程可能与HWP1基因的表达水平存在一定的内在联系。生物膜的形成在白念珠菌耐药机制中有重要地位, HWP1基因是否同样和细菌耐药性相关呢?本研究中耐药菌株的HWP1基因体外表达水平没有明显高于非耐药菌株, 这到底是这两者之间本身没有关联, 还是我们研究的菌株数量不足的原因, 有待进一步增加菌株数量深入研究。

我们的研究是有局限性的。首先, 我们菌株来源重点考虑的是有无临床症状、符不符合RVVC的诊断标准、是否用药等, 我们没有针对RVVC患者或定植者的年龄因素展开分析。阴道菌群的分布随着年龄在改变[19], RVVC患者或定植者分离的白念珠菌的生物膜、SAP、 PL、Lip和HWP1基因表达可能会因为年龄不同而不同, 我们没有考虑年龄因素, 可能对我们的实验结果产生干扰。其次, 我们只研究了5种抗真菌药物的耐药性, 可能在非耐药性菌株中也存在对其他抗真菌药物耐药的情况, 这可能也会对我们的部分实验结果产生干扰。第三, 白念珠菌对于不同的抗真菌药物的耐药机制存在差异, 我们没有单独研究每一种抗真菌药物的耐药菌株与非耐药性菌株生物膜、SAP、 PL、Lip和HWP1基因表达的差异性。最后, 我们只研究了100株阴道白念珠菌, 特别是仅有23株耐药性菌株, 标本量的不足也使我们的研究有局限性。

综上所述, 白念珠菌的毒力因子生物膜、SAP、 PL、Lip和HWP1都可能在RVVC的致病过程中发挥了重要作用, HWP1与生物膜的形成呈弱相关性, 生物膜的形成与阴道白念珠菌的耐药性产生可能存在关联, 但还需进一步研究。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：黄艳

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