2008年, 报道的“ 柏林病人” 因患急性髓细胞白血病后接受了纯合CCR5Δ 32突变的个体骨髓移植, 体内的艾滋病毒感染完全消失, 是世界上首次报道的成功治愈的艾滋病患者。近年来, 这一令人瞩目的成就已成为世界各行各业人们关注的焦点, 并试图复制^[5]。2019年3月, 多位科学家在Nature杂志上报道了世界上第二例干细胞移植后 HIV-1 感染缓解的病例, 即“ 伦敦病人” ^[6]。这位HIV-1感染患者接受了造血干细胞移植治疗霍奇金淋巴瘤, 细胞供体具有CCR5基因32个碱基对（bp）纯合缺失（CCR5Δ 32/Δ 32）。该患者在接受干细胞移植并停用抗病毒药18个月后, 体内的HIV-1病毒载量持续维持在检测限以下。

关于“ 伦敦病人” 的研究, 在报道停止服用ART药物后18个月血浆中HIV病毒载量和12个月（2019年3月至2020年3月）的进展后, 又继续观察了30个月。期间患者血浆中HIV病毒载量在停药后30个月依旧无法检测到。精液、脑脊液和穿刺组织活检中HIV病毒载量都低于检测限。移植造血干细胞形成的嵌合率能够达到99%的比例。患者的CD4细胞数也恢复到正常水平。通过微滴数字PCR（droplet digital PCR）证明了HIV基因组含量低且不完整。RT-PCR也显示出相似的结果, 同时证明了HIV包装信号ψ 的缺失。这些证明了HIV基因的缺失不足以导致HIV复发。患者体内CD4⁺和CD8⁺T细胞无对HIVgag的特异性免疫反应。进一步研究发现, 虽然患者体内仍存在一定量的HIV抗体, 但这些抗体的亲和力明显下降, 表明该患者已在临床上治愈。此外, 通过基于病毒储存库动力学和反弹的随机数学模型模拟无ART反弹时间、无反弹和目标细胞免受感染的比例, 研究人员认为, 在90%嵌合体的情况下, “ 长期缓解” 的概率高于99%。长期以来, 患者的嵌合率稳定了99%。这再次证明了利用CCR5突变的造血干细胞移植治疗艾滋病的可能, 也为靶向基因编辑系统的临床实施提供了经验和指引^[7]。

RNA干扰机制是使用双链RNA分子（dsRNA）通过切割触发相应mRNA失活。靶向的短发夹RNA（shRNA）分子可以损害CCR5表达^[16]。RNA干扰（RNAi）已发展成为一种以序列特异性方式调节基因表达的强大工具, 可用于灭活CCR5mRNA。短发夹RNA（shRNA）分子可影响CCR5表达, 但是可能会引起意想不到的副作用, 并且在缺乏Dicer的细胞（如单核细胞）中不会被加工。人工shRNA进入RNAi途径不需要Drosha处理即可去除任何侧翼序列。shRNA由细胞质Dicer核酸内切酶处理, 该酶产生带有主动引导链和假定为非活跃乘客链的小干扰RNA（siRNA）。引导链对RNAi诱导的沉默复合体（RISC）进行编程, 以完美的序列互补性切割mRNA。Ago蛋白质是一类庞大的蛋白质家族, 是组成RISCs复合物的主要成员。在人当中, Ago2“ 筹划” 了RISCs对于目标mRNA的切割过程。AgoshRNA与常规shRNA的不同之处在于, 其环更小（5 nt）, 茎长更短（18 bp）。AgoshRNA太小而无法被Dicer加工, 而是被Ago2加工以生成单个引导链, 从而避免了常规shRNA的过客链的脱靶效应^{[17, 18]}。通过一系列实验证明了针对HIV-1的CCR5共受体产生有效的AgoshRNA可以降低CCR5的表达, 显著保护T细胞免受CCR5热带HIV-1感染, 引起了持续的抗病毒作用, 并没有细胞毒性作用。可以说AgoshRNA疗法的未来前景广阔^[19]。

转录基因沉默（TGS）, 其中小的非编码RNA通过靶向病毒启动子内的位点, 特别是5'长末端重复序列（LTR）, 直接抑制HIV-1的转录活性。基于基因的疗法代表了治疗HIV-1的有前途的治疗范例, 有可能通过减少干预措施来维持持续的病毒抑制作用。这种选择可能代表了高效抗逆转录病毒疗法的长期治疗替代方案。TGS与传统的RNA干扰（RNAi）的不同之处在于, 其特征是在组蛋白和DNA上伴随着沉默状态表观遗传标记。为了提供诱导TGS的RNA, 使用了基于先前报道的gp120（A-1）适体与27-merDicer底物抗HIV-1 siRNA（dsiRNA）LTR-362结合的双重功能, 开发了功能性RNA结合物。结果证明, gp120适体-dsiRNA偶联物设计适用于全身递送可用于抑制HIV-1的小RNA^[20]。

锌指核酸酶（ZFN）是一类通用的真核转录因子, 通过锌指基序结合DNA。这些DNA结合基序与Fok 1限制性内切核酸酶的核酸酶结构域连接, 以产生ZFN^[16]。ZFN是第一种真正靶向蛋白质的试剂, 彻底改变了研究的基因组操作领域。ZFN是DNA的结合域, 可识别靶位点上的3个碱基对^[21]。近期关于ZFN的最新研究较少。

用于精确基因组编辑的TALEN系统是一种已被广泛采用的方法, 已经使用了几年^[22]。通过将FokI切割结构域与TALE蛋白的DNA结合结构域合并在一起, 形成了TALEN。对于单个碱基对的有效版, TALE包含34个氨基酸的多重重复^[23]。像ZFN一样, TALENs也促进靶向的DSB, 从而帮助启动负责DNA损伤并确保修饰的途径^[24]。TALEN系统中涉及的蛋白质包括负责结合DNA的中央结构域和核定位序列^[25]。

研究表明一种经过工程改造的TALEN, 可在造血细胞中进行有效的CCR5编辑。通过电穿孔将编码TALEN的mRNA转移至原代CD4⁺T细胞后, 多达89％的CCR5等位基因被破坏。基因分型证实了所编辑细胞的遗传稳定性, 全基因组脱靶分析证实了相关诱变事件的缺失。当用R5嗜性HIV攻击编辑过的T细胞时, 观察到剂量依赖性的保护作用。功能评估显示, 经编辑的CD4⁺T细胞与对照CD4⁺T细胞在增殖及其在外源性刺激下分泌细胞因子的能力方面无显着差异。虽然在^{[26, 27, 28]}之前采用TALENs破坏人细胞中的CCR5, 但结合新的RNA转移技术改进的TALEN设计^[29]能够在CD4⁺T细胞中敲除CCR5, 并具有很高的活性和高特异性。制成的T细胞具有HIV抵抗力, 遗传稳定性并保持其效力。通过实验成功地设计了一种高活性和高特异性的TALEN来破坏CCR5, 为其在造血干细胞移植中的临床应用铺平了道路^[13]。

3.4.1 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术 与TALENs相似, CRISPR相关蛋白9（Cas9）也是可编程的DNA核酸酶。但是, 其操作方式在几个方面有所不同：首先, Cas9具有先天的核酸酶活性。该酶作为单体具有活性并催化DSB的功能^[30]。其次TALENs和Cas9之间的两种蛋白识别其基因组靶位点的方式不同。虽然TALENs在其DBD的氨基酸序列中编码DNA靶标基序特异性, 但Cas9需要单个嵌合向导RNA（sgRNA）才能识别其靶标位点^[31]。对于TALENs, 必须为每个目标位点精心设计其DBD的氨基酸序列。而只需通过共同表达目标位点, 即可将一个不变的Cas9核酸酶靶向多种DNA, 通过共同表达目标位点特定sgRNA来表示。正是这种简单的可编程性使得CRISPR/Cas9平台可以快速替代其他基因组编辑平台, 其中包括ZFN和TALEN^[32]。

有研究发现一种通过CRISPR-Cas9基因组编辑技术诱导CCR5Δ 32/Δ 32纯合子的简单方法^[33]。设计一对靶向CCR5Δ 32突变位点侧翼区域的单向导RNA, 然后通过CRISPR-Cas9和慢病毒包装系统成功地将野生型CCR5转化为人Jurkat CD4⁺细胞系和原发性CD4⁺中的CCR5D32/D32纯合子细胞, 与自然发生的CCR5Δ 32/Δ 32突变完全相同。在Jurkat细胞中, 成功率只有20％, 而在原代CD4⁺细胞中, 成功率则更低。修饰的CCR5Δ 32/32 CD4⁺细胞对CCR5嗜性HIV感染具有抗性。全基因组测序显示没有明显的脱靶位点。这项研究成功诱导CCR5Δ 32/Δ 32纯合子。这种方法和其他研究正在推动独特的“ 柏林病人” 接受基于细胞的艾滋病毒/艾滋病治疗。目前, 有5种CRISPR/Cas9方法可用于抵抗HIV感染：（1）直接靶向预先整合的原病毒dsDNA; （2）早期敲除期宿主共受体因子CCR5; （3）切割长末端重复序列（LTR）的病毒基因组; （4）切割负责释放的病毒基因; （5）靶向潜伏性细胞的再激活, 随后采用ART和抗病毒机制进行随后的“ 电击和杀死” 策略。对于CRISPR/Cas9系统, 需要考虑的关键因素是：（1）设计特定的sgRNA以减少潜在的靶向作用。（2）有效地将大复合物有效地递送到感染细胞中, 尤其是穿过血脑屏障（即纳米叶片）。（3）包含消除HIV的特定药物（即潜伏时间逆转药物）。（4）了解CRISPR/Cas9介导的病毒逃逸并制定有效的策略。尽管人源化的小鼠模型产生很好的结果^[34], 但重要的是要了解为什么许多实验小鼠无法治愈。更重要的是, 还有其他对于人类消除艾滋病毒至关重要的方面, 包括将CRISPR构建体传递到人体各部分的能力^[35]。

3.4.2 CRISPR/Cpf1基因组编辑技术 尽管CRISPR/Cas9曾用于HIV-1研究, 但新开发的CRISPR/AsCpf1从未用于HIV-1共受体破坏。CRISPR/Cpf1系统与CRISPR/Cas9相比具有许多优势, 例如靶标低, 核酸酶尺寸小, 易于sgRNA设计以进行多重基因编辑等。因此, CRISPR/Cpf1介导的基因编辑将赋予更特异性和特异性。HIV-1共受体破坏的安全策略证明了CRISPR/AsCpf1可以通过两种筛选的sgRNA通过不同的递送策略（慢病毒, 腺病毒）有效地消灭HIV-1感染的主要共受体CCR5。该项研究为CRISPR/AsCpf1编辑具有针对HIV-1感染的高特异性sgRNA的CCR5靶向基因的可能应用提供了基础^[36]。