引用本文
李雪, 凌峰, 屈志强, 罗密芳, 黄燕翠, 韦舒琳, 刁书琴. 南宁市2021年白纹伊蚊抗药性和病原学监测研究[J]. 中国热带医学, 2022,22(6): 540-543.
LI Xue, LING Feng, QU Zhi-qiang, LUO Mi-fang, HUANG Yan-cui, WEI Shu-lin, DIAO Shu-qin. Insecticide resistance status and pathogeny surveillance of Aedes albopictus in Nanning, 2021 [J]. China Tropical Medicine, 2022,22(6): 540-543.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.06.10
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南宁市2021年白纹伊蚊抗药性和病原学监测研究
李雪, 凌峰*, 屈志强, 罗密芳, 黄燕翠, 韦舒琳, 刁书琴
南宁市疾病预防控制中心,广西 南宁 530023
*通信作者：凌峰,E-mail：lfeng2000@163.com

作者简介：李雪（1987—）,女,硕士,研究方向：病媒生物防制。

收稿日期: 2022-03-02
基金资助: 广西医药卫生自筹经费科研课题（No. 20190792,Z20201224）
摘要

目的 掌握南宁市白纹伊蚊对常用杀虫剂的抗药性程度和病毒携带率,为合理选择、使用杀虫剂及蚊媒生物传染病的风险评估和预测预警提供科学依据。方法 白纹伊蚊抗药性监测分别采用成蚊接触筒法、幼虫浸渍法对拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂进行敏感性测定,并运用SPSS 20.0 进行统计学分析;白纹伊蚊病原学监测采用半巢式RT-PCR法对黄病毒属和甲病毒属进行检测。结果 2021年南宁市白纹伊蚊抗药性监测结果显示,白纹伊蚊幼虫对高效氯氰菊酯、残杀威LC50分别为0.261、4.978 mg/L,抗性倍数分别为48.253、5.591,抗性水平分别为高抗和抵抗;成蚊高效氯氰菊酯、残杀威、马拉硫磷药纸死亡率分别为57%、80%、100%,抗性水平分别为抗性、可能抗性和敏感;2021年南宁市白纹伊蚊病原学监测结果显示,野外采集的白纹伊蚊雌性成蚊共2 199只,黄病毒属和甲病毒属病毒检测结果显示均未扩增出阳性条带。结论 南宁市白纹伊蚊幼虫及成蚊对高效氯氰菊酯和残杀威存在不同程度抗药性,应参照抗药性检测结果,结合当地实际情况,高抗或抗性杀虫剂应停用一段时间,低抗或疑似抗性杀虫剂应轮换使用或复配使用,以降低蚊虫选择压力,延长杀虫剂使用寿命。南宁市野外品系白纹伊蚊可能尚未携带黄病毒属和甲病毒属病毒或携带率处在较低的水平,应持续监测,预防蚊媒传染病的传播。

关键词: 白纹伊蚊; 抗药性; 病原学
中图分类号:R384.1 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)06-540-04
Insecticide resistance status and pathogeny surveillance of Aedes albopictus in Nanning, 2021
LI Xue, LING Feng, QU Zhi-qiang, LUO Mi-fang, HUANG Yan-cui, WEI Shu-lin, DIAO Shu-qin
Nanning Center for Disease Control and Prevention, Nanning, Guangxi 530023, China
Corresponding author: LING Feng, E-mail: lfeng2000@163.com.
Abstract

Objective To understand the resistance status and the virus-carrying rate of Aedes albopictus in Nanning city, and to provide evidence for scientific use of insecticides, risk assessment and early warning of mosquito-borne infectious diseases.Methods Adult mosquito exposure chamber method and larva immersion method were utilized to test insecticide resistance of pyrethroids, carbamates and organophosphates, and SPSS20.0 for statistical analysis. Hemi-nested RT-PCR assay was used for detection of mosquito-borne alphaviruses and flavivirus.Results The results of resistance status of Aedes albopictus in 2021 in Nanning showed that, the LC50 of larvae mosquitos on beta eyper-methrrin and propoxur were 0.261 mg/L and 4.978 mg/L, and the resistance multiple were 48.253 and 5.591. The resistance level were high resistance and low resistance, respectively. After exposure to beta eyper-methrrin, propoxur and malathion, the mortality of adult mosquitoes were 57%, 80% and 100%, and the resistance multiple were resistance population, doubtful drug resistance and sensitive population, respectively. The results of pathogeny surveillance of Aedes albopictus in 2021 in Nanning City show that, a total of 2 199 samples of female adult wild line Aedes albopictus were collected, flavivirus and alphaviruses were not detected in the wild line Aedes albopictus in Nanning.Conclusions The larvae and adult Aedes albopictus in Nanning have developed resistance to beta eyper-methrrin and propoxur. Local use of insecticides should be guided based on local conditions and the monitoring results; high resistance insecticides should be stopped for a period of time, and the insecticides to which Aedes albopictus has developed medium and low resistance or suspected resistance should be used alternately or in combination, in order to reduce the selection pressure of mosquitoes and prolong the service life of insecticides. Mosquito-Borne flavivirus and alphaviruses carried by Aedes albopictus on the outskirts of Nanning were not detected or at a low level. Continuous monitoring should be carried out to prevent the spread of mosquito borne diseases.

Keyword: Aedes albopictus; insecticides resistance; etiology

蚊虫是地球上对人类健康危害最为严重的动物, 世界卫生组织（WHO）报告显示, 每年在全球范围内因蚊媒传染病造成严重的疾病经济负担相当大[1]。白纹伊蚊（Aedes albopictus）是我国重点防控的虫媒病传播媒介种类之一, 同时也是南宁城区的主要蚊种之一。伊蚊是登革病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒和新德毕斯病毒等的传播媒介。随着国际贸易、劳务输出、文化交流和旅游等活动的日益增加, 2008 年南宁市开始出现输入性登革热。南宁市2014年曾出现过登革热病例的暴发流行, 当年报告病例为 722 例（其中本地病例709例、输入病例 13例）, 2019 年南宁市共报告登革热病例 1 078例（本地病例1 020 例、输入病例 58 例）。而目前预防登革热没有有效的疫苗, 降低伊蚊的密度是登革热防控的唯一有效途径, 化学防治是目前控制白纹伊蚊密度的重要手段之一。随着杀虫剂使用的强度和广度不断加大, 白纹伊蚊产生抗药性的风险也越发加大。通过对蚊媒病毒快速有效的检测, 对预防和控制蚊媒传染病的传播具有重要的意义; 提高灭蚊效果、控制蚊媒密度, 是迅速做好切断传播途径、控制疾病蔓延的重要前提[2, 3]。

1 材料与方法
1.1 试虫

白纹伊蚊抗药性检测所需试虫采用勺捞法, 南宁市东、西、南、北、中不同方位的城市居民区、公园、医院、城乡结合部、农村等生境采集幼虫, 移入实验室饲养, 用F1代试虫进行抗药性检测。成蚊挑选羽化后3~5 d的健康雌蚊, 幼虫挑选Ⅲ 龄末至Ⅳ 龄初的幼虫进行测定。

白纹伊蚊病原学检测所需试虫采用人诱停落法采集成蚊, 采集地点为南宁市兴宁区和宾阳县的居民区、公园（含街心公园）、医院、牲畜棚（牛棚、猪圈、羊圈、养殖场等）等, 采集到的试虫装入蚊蝇饲养笼, 立即送到实验室进行分类鉴定。将采集的活蚊虫置于 -20 ℃冰箱10~20 min, 冻晕后进行分类鉴定, 将雌性白纹伊蚊分装于冻存管内并添加RNAlater储存液, 每管20~30只, 4 ℃过夜, 第2天放置-80 ℃以下条件保存。

1.2 抗药性检测

采用WHO推荐的幼虫浸渍法和成蚊接触筒法分别测定白纹伊蚊幼虫和成蚊的抗药性。

1.2.1 杀虫药剂 幼虫杀虫剂：97%残杀威、95.8%高效氯氰菊酯原药; 成蚊药膜：0.5％马拉硫磷, 0.4％高效氯氰菊酯, 0.05％残杀威。以上测试用药品及药膜均由中国疾病预防中心传染病预防控制所媒介室提供, 为全国重要病媒生物抗药性监测用标准品。

1.2.2 抗性判定标准 幼虫：抗性倍数< 3为敏感; 3≤ 抗性倍数< 10为低抗; 10≤ 抗性倍数< 40为中抗; 抗性倍数≥ 40为高抗。成虫：死亡率> 98％为敏感群体（S）; 死亡率80％~97％为可能抗性群体（M）; 死亡率< 80％为抗性群体（R）[4]。

1.3 病原学检测

白纹伊蚊病原学检测采用半巢式RT-PCR法, 检测黄病毒属[5]和甲病毒属[6]病毒。

1.3.1 主要试剂和仪器 检测所用试剂主要有磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒（天根）、onestep RT-PCR kit(QIAGEN)、2× Taq PCR预混试剂Ⅱ （天根）等, 主要仪器设备为组织破碎仪（天根TGrinder H24）、核酸提取仪（天根TGuide S32）、PCR仪（杭州博日科技）, 凝胶成像系统（UVITEC1）等。

1.3.2 核酸提取 将每个冻存管里的样本移入含 0.5 mL的Hank's液的研磨管中进行研磨, 研磨后参照磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒（天根）说明书进行提取。

1.3.3 引物合成 参照薛志静等[5, 6]文献里的引物, 序列见表1, 引物及阳性质粒由中国疾病预防控制中心提供。

表1 用于甲病毒属和黄病毒属病毒半巢式PCR扩增的引物 Table 1 Primers for RT-hemi-nested PCR of Alphaviruses and Flavivirus

1.3.4 半巢式 PCR 扩增 第一轮PCR反应体系配置参照onestep RT-PCR kit(QIAGEN), PCR 反应条件为：50 ℃反转录反应30 min, 95 ℃ PCR初始激活15 min, 95 ℃变性30 s, 甲病毒属54 ℃退火30 s（黄病毒属52 ℃退火30 s）, 72 ℃延伸30 s, 反应30循环, 最后72 ℃延伸5 min。第二轮PCR反应体系为25 μ L, 配置参照2× TaqPCR预混试剂Ⅱ （天根）, PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 甲病毒属60 ℃, 30 s（黄病毒属56 ℃, 30 s）; 72 ℃ 45 s, 共30个循环; 72 ℃延伸 5 min。将得到的 PCR 产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果
2.1 白纹伊蚊抗药性检测结果

白纹伊蚊成蚊对高效氯氰菊酯、残杀威和马拉硫磷24 h死亡率分别为57％、80％和100％, 表明对高效氯氰菊酯表现为抗药性, 对残杀威表现出可疑抗性, 对马拉硫磷表现为敏感。白纹伊蚊成蚊对常用杀虫剂的抗药性测定结果见表2。白纹伊蚊幼虫对高效氯氰菊酯、残杀威的LC50分别为0.261、4.978 mg/L, 抗性倍数分别为48.253和5.591。抗性水平分别为高抗和抵抗。见表3。

表2 南宁市白纹伊蚊成蚊抗药性检测结果 Table 2 Resistance of adult mosquito of Aedes albopictus mosquito to insecticides in Nanning
表3 南宁市白纹伊蚊幼虫抗药性检测结果 Table 3 Resistance of the larvae of Aedes albopictus mosquito to insecticides in Nanning
2.2 白纹伊蚊病原学检测结果

共采集2 199只雌性白纹伊蚊, 记录好采集时间、地点、数量, 每管20~30只, 总共93管。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测, 均未发现有甲病毒属和黄病毒属病毒阳性扩增条带。

3 讨论

本研究结果显示, 南宁地区白纹伊蚊幼虫对高效氯氰菊酯为高抗, 对残杀威为低抗, 与广州大学城[8]（残杀威低抗, 2020年）一致, 与南昌市[9]（高效氯氰菊酯、残杀威均高抗, 2019 年）部分一致; 成蚊对高效氯氰菊酯表现为抗药性, 对残杀威表现出可疑抗性, 对马拉硫磷表现为敏感, 与广州大学城一期2020年抗药性调查结果[8]一致, 与国内其他地方的研究不尽相同[10]。以上各地区的白纹伊蚊抗药性研究反映了抗药性普遍存在和程度各不相同的问题。抗性的产生和发展受很多因素影响, 如使用杀虫剂的性质和类别、使用方法、施药剂量等。通过现场监督和与有害生物防治公司沟通中了解到, 近年南宁市区施放的杀虫剂种类主要是≥ 10%高效氯氟氰菊酯微囊悬浮剂、≥ 10%高氯残杀威悬浮剂、氯菊烯丙菊水乳和双硫磷· 吡丙醚颗粒等。因2021年南宁市创卫生城复评审, 杀虫剂的大量使用, 易产生抗药性。抗药性的产生还与家用杀虫剂相关, 拟除虫菊酯类多应用于家庭电热蚊香液和家庭杀虫气雾剂, 因此其抗性产生和抗性程度较其他种类杀虫剂明显。下一步监测应增加常用杀虫剂的抗药性监测, 并结合当地实际情况, 持续监测白纹伊蚊对常用杀虫剂的抗性水平, 依据抗药性监测结果, 有针对性地选择较敏感的杀虫剂, 或者高抗/抗性杀虫剂停用一段时间, 低抗或疑似抗性杀虫剂轮换使用或复配使用, 避免长期使用同一种类的杀虫剂而引起抗性增加, 减缓抗药性的迅速发展, 科学合理使用杀虫剂、保障杀灭效果。

对于病毒携带率方面, 本次研究未检测出黄病毒属和甲病毒属病毒, 与马敏等[11]结果一致, 表明南宁市野外品系白纹伊蚊可能尚未携带黄病毒属和甲病毒属病毒或携带率处在较低的水平。2008— 2017年南宁市登革热病例输入来源主要是东南亚, 其次是国内的广东省, 鲜见从美洲、非洲、西太平洋地区和南亚等其他登革热疫情高发区输入者, 说明南宁市受东南亚和广东省的登革热疫情威胁最大。根据高玉峰等[12]的研究表明, 西南边境口岸地区蚊虫病毒感染率较高, 黄病毒属和甲病毒属病毒均有检出, 蚊媒病原学检测是有效降低传染病输入输出风险的重要手段。白纹伊蚊病毒携带率低, 且病毒很容易失活, 检测时经常出现全部未检出现象, 大量样本是获得蚊类检测阳性结果的重要条件[13]。诱蚊诱卵器法采集的蚊虫大部分为吸血后产卵的蚊虫, 用作病毒检测可能效果更好, 但诱蚊诱卵器法很难采集到足够数量的成蚊标本[14, 15]。下一步监测应扩大采样范围、增加生境类型、增加采样频次以及增加采样和检测方法等, 以提高检测阳性率。此外, 如有检测阳性的样本, 还应对检出的毒株开展序列分析工作, 为传染源的溯源和精准防控提供依据。

南宁市区自然环境适合白纹伊蚊孳生繁殖, 伊蚊广泛分布、密度高, 存在因蚊媒传染病输入性病例未能有效控制而引发本地疫情暴发的风险。因此, 应持续加强对白纹伊蚊的监测和防控, 防患于未然。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：黄艳

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