引用本文
刘玉婷, 潘翔, 逯军. 25例基因拷贝数变异致罕见遗传病临床分析[J]. 中国热带医学, 2022,22(6): 585-590.
LIU Yu-ting, PAN Xiang, LU Jun. Clinical analysis of 25 cases of rare genetic diseases caused by gene copy number variation[J]. China Tropical Medicine, 2022,22(6): 585-590.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.06.19
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25例基因拷贝数变异致罕见遗传病临床分析
刘玉婷, 潘翔, 逯军*
中南大学湘雅医学院附属海口医院,海南 海口 570208
*通信作者：逯军,E-mail：Lu139762@163.com

作者简介：刘玉婷（1986—）,女,本科,主治医师,研究方向：儿内科疾病及罕见病。

收稿日期: 2021-12-03
摘要

目的 探讨基因拷贝数变异致罕见遗传病患儿的临床表现及基因拷贝数变异检测在罕见遗传病诊断中的价值。方法 回顾分析2013年2月至2021年2月就诊于中南大学湘雅医学院附属海口医院儿科的25例基因拷贝数变异致罕见遗传病患儿的临床表现,并将其分为染色体微缺失/微重复综合征组和单基因遗传病组,使用Fisher确切概率法统计患儿临床表型在两组出现频率的差异。结果 25例患儿中,男性12例（48.00%）,女性13例（52.00%）;平均发病年龄为（1.20±2.24）岁;起病形式不同,急性起病7例（28.00%）,慢性起病18例（72.00%）。25例患儿临床表型复杂多样,主要有12种。将其分为两组,分别为17例染色体微缺失/微重复综合征（68.00%）,8例单基因遗传病（32.00%）;“生长发育迟缓/智力低下”“面容异常”和“先天畸形”三种临床表型的差异在两组之间具有统计学意义。25例患儿中有23例（92.00%）首先行基因全外显子测序,未发现致病性点突变,进一步行基因拷贝数变异检测明确诊断;2例（8.00%）则直接行拷贝数变异检测明确诊断。结论 基因拷贝数变异致罕见遗传病大部分在婴幼儿时期起病,男性与女性发病率大致相同,其涉及病种多,临床表型复杂,“生长发育迟缓/智力低下”“面容异常”和“先天畸形”三种临床表型在染色体微缺失/微重复综合征出现的概率高。基因拷贝数变异检测是诊断罕见遗传病的重要手段,可作为基因全外显子测序的补充,从而在一定程度上提高罕见遗传病的诊断水平。

关键词: 基因拷贝数变异; 遗传病; 基因检测; 发育异常
中图分类号:R394 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)06-585-06
Clinical analysis of 25 cases of rare genetic diseases caused by gene copy number variation
LIU Yu-ting, PAN Xiang, LU Jun
Department of Pediatrics, The Affiliated Haikou Hospital of Xiangya Medical College, Central South University, Haikou, Hainan 570208, China
Corresponding author: LU Jun, E-mail: Lu139762@163.com
Abstract

Objective To investigate the clinical manifestations of children with rare genetic diseases caused by gene copy number variation and the value of gene copy number variation detection in the diagnosis of rare genetic diseases.Methods The clinical manifestations of 25 children with rare genetic diseases caused by gene copy number variation who were treated in the Department of Pediatrics, The Affiliated Haikou Hospital of Xiangya Medical College, Central South University from February 2013 to February 2021 were retrospectively analyzed, and they were divided into chromosomal microdeletion/microduplication syndrome group and the single-gene genetic disease group, Fisher's exact probability method was used to count the differences in the frequency of clinical phenotypes between the two groups.Results Among the 25 children, there were 12 males (48.00%) and 13 females (52.00%); the average age of onset was （1.20±2.24） years old; the onset forms were different, with acute onset in 7 cases (28.00%) and chronic onset in 18 cases (72.00%). The clinical phenotypes of the 25 children were complex and diverse, mainly including 12 types. They were divided into two groups, including 17 cases of chromosomal microdeletion/microduplication syndrome (68.00%) and 8 cases of monogenic hereditary disorders (32.00%). Differences in the clinical phenotypes of "growth retardation/hypophrenia", "abnormal facial features" and "congenital malformations" were statistically significant between the two groups. In 23 of the 25 cases (92.00%), gene whole exon sequencing was performed first, and no pathogenic point mutation was found, and gene copy number variation was further tested to confirm the diagnosis. 2 cases (8.00%) were diagnosed by copy number variation test.Conclusions Most of the rare genetic diseases caused by gene copy number variation start in infancy and young children, and the incidence of males and females are roughly the same. It involves a variety of diseases and complex clinical phenotypes. The three clinical phenotypes "growth retardation/hypophrenia", "abnormal facial features" and "congenital malformations" in chromosomal microdeletion/microduplication syndrome with a high probability. Gene copy number variation detection is an important means of diagnosing rare genetic diseases, which can be used as a supplement to whole exome sequencing of genes, thereby improving the diagnostic level of rare genetic diseases to a certain extent.

Keyword: Gene copy number variants; Genetic diseases; Genetic testing; Abnormal abnormalities

人类基因组中存在多种形式的遗传变异和DNA多态性, 其中单核苷酸变异（single nucleotide variant, SNV）早已为人所深知, 是指基因组DNA序列中单个碱基的改变, 又被称为点突变。人群中突变频率低于1%的SNV一般具有致病意义, 而突变频率高于1%的SNV常被称为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）。基因拷贝数变异（copy number variation, CNV）是指在染色体上长度大于1 kb的基因组拷贝数减少（缺失）或增加（重复）, 又称为亚显微水平的基因组微失衡[1]。长度在1 kb以内、介于SNV和CNV之间的DNA碱基插入/缺失（insertion/deletion, Indel）, 称为小片段Indel。基因组CNV、SNV和小片段Indel均属于遗传物质变异范畴。在发生频率上, 基因组CNV的变异频率远高于SNV, 约为10-4~10-5, 是SNV变异频率的1 000~10 000倍[2]。近10年随着遗传学检测技术发展和全基因组关联分析等研究的深入, 人们发现CNV是导致儿童出生缺陷、生长发育迟缓/智力低下、多发畸形、癫痫和孤独症谱系障碍等疾病的重要致病因素。

CNV根据基因型的不同, 分为染色体微缺失/微重复综合征（microdeletion and microduplication syndromes, MMSs）和单基因遗传病（monogenic hereditary diseases, MHDs）。本研究将25例确诊CNV致罕见遗传病的患儿分为MMSs和MHDs两组, 通过统计学分析, 对比其临床表型与基因变异特点, 总结诊断经验以提高临床医生对罕见遗传病的认识, 提高诊断率, 避免误诊、漏诊。

1 对象与方法
1.1 研究对象

对2013年2月至2021年2月期间就诊于中南大学湘雅医学院附属海口医院儿科的25例确诊CNV致罕见遗传病患儿进行回顾性分析。本研究均获得患儿父母（或法定监护人）知情同意, 并签署知情同意书。已通过中南大学湘雅医学院附属海口医院伦理委员会审核和批准, 伦理批文编号：2019-（伦审）-041。

1.1.1 纳入标准 符合以下所有条件：①年龄0~14岁; ②检出CNV经美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南评级为致病性变异或可能致病性变异; ③基因型和临床表型相符合; ④本研究入组的罕见遗传病筛选标准为Orphanet网站公布的“ 欧盟国家罕见疾病目录” （http://www.orpha.net）。

1.1.2 排除标准 符合以下任一条件：①年龄> 14岁; ②基因型与临床表型不相符; ③检出的CNV经美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南评级为“ 临床意义不明变异” 、“ 可能良性变异” 和“ 良性变异” ; ④患儿父母（或法定监护人）拒绝加入研究。

1.2 方法

分析25例CNV致罕见遗传病患儿的临床资料。将其分为2组, MMSs组17人; MHDs组8人。25例患儿所用到的CNV检出方法有全外显子联合CNV分析、染色体微阵列分析、低深度全基因组测序、实时荧光定量PCR、多重连接酶依赖探针扩增和变性高效液相色谱分析。通过回顾分析, 探讨CNV检测技术在罕见遗传病诊断中的价值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件和Microsoft Office Excel 2019对研究数据进行统计处理分析, 使用K-S检验数据的正态性, 服从正态分布的数据采用（x± s）表示, 非正态分布数据则采用算术平均数表示, 计数资料数量用例（%）表示。采用Fisher确切概率法对比主要临床表型在MMSs和MHDs两组患儿中出现频率的差异, P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 一般资料

本研究25例CNV致罕见遗传病患儿男性12例（48.00%）, 女性13例（52.00%）, 男女性别比约为0.92∶ 1。平均发病年龄为（1.20± 2.24）岁, 婴幼儿期是发病高峰期; 急性起病7例（28.00%）, 慢性起病18例（72.00%）。

2.2 临床表型分析

25例CNV致罕见遗传病患儿临床表型分类统计, 见表1。由于样本量小于40, 采用Fisher确切概率法对比各临床表型在MMSs组和MHDs组患儿中出现例数差异, 结果显示“ 生长发育迟缓/智力低下” “ 面容异常” 和“ 先天畸形” 三种临床表型在MMSs组出现例数较MHDs组多, 且差异具有统计学意义（P< 0.05）; “ 早期喂养困难” “ 反复感染” “ 身材矮小” “ 运动发育落后” “ 肌无力” “ 癫痫” “ 肌张力异常” “ 血液系统异常” 和“ 精神异常” 在两组患儿中出现例数差异无统计学意义（P> 0.05）。

表1 本研究25例CNV所致罕见遗传病主要临床表型对比分析 Table 1 Comparative analysis of the main clinical phenotypes of 25 rare genetic diseases caused by CNV
2.3 CNV检测结果分析

25例患儿通过CNV检测均发现致病性拷贝数变异。染色体异常与临床表型相符合。包含22q11.2缺失综合征8例（32.00%）, Duchenne型肌营养不良4例（16.00%）, 脊髓性肌萎缩症、Miller-Dieker综合征、Turner综合征、小眼畸形综合征5型、先天性高胰岛素血症、17q12 微缺失综合征、6p25微缺失综合征、Angelman综合征、Leri-Weill软骨发育不良、威廉姆斯综合征、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、复合型甘油激酶缺乏症和A20单倍剂量不足各1例（各占4.00%）。25例CNV所致罕见遗传病, 包含染色体微缺失/微重复综合征（MMSs）17例（68.00%）, 单基因遗传病（MHDs）8例（32.00%）。本组患儿共涉及15个罕见遗传病病种, 其中有8个病种（8/15, 53.33%）被纳入中国《第一批罕见病目录》[4]。23例（92.00%）首先行基因全外显子测序, 均未发现致病性单核苷酸变异（点突变）和小片段插入/缺失（< 1 kb）, 进一步完善基因拷贝数变异（> 1 kb）检测后均明确诊断; 2例（8.00%）则直接行拷贝数变异检测明确诊断。结果见表2。

表2 本研究25例CNV所致罕见病患儿检测结果及临床表现 Table 2 Examination results and clinical manifestations of 25 children with rare diseases caused by CNV
3 讨论

罕见病又被称为“ 孤儿病” , 是发病率很低、很少见的疾病。中国罕见病定义为人群患病率低于 1/500 000或新生儿发病率低于1/10 000的疾病[5]。绝大多数罕见病有遗传基础, 其他的致病原因包括感染、环境毒理、饮食及化学物理暴露等, 进一步鉴别是否为遗传性疾病对患儿的治疗、预后评估、下一代优生优育等有重要意义。CNV致罕见遗传病在罕见病中的发病率尚无报道。本研究中, 2013年2月至2021年2月期间就诊于中南大学湘雅医学院附属海口医院儿科的罕见病共有67例, 其中25例确诊CNV致罕见遗传病, 占37.00%, 说明CNV是导致罕见遗传病的重要原因。本研究25例患儿中, 23例首先行基因全外显子测序, 均未发现致病性单核苷酸变异（点突变）和小片段插入/缺失（< 1 kb）, 进一步完善基因拷贝数变异（> 1 kb）检测后均明确诊断; 2例则直接行拷贝数变异检测明确诊断, 说明单纯通过基因全外显子对罕见遗传病进行检测, 漏诊率极高。

基因组CNV的检测技术有染色体核型分析技术、荧光原位杂交（flourescence in situ hybridization, FISH）技术、实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR, qPCR）技术、多重酶依赖探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）技术、染色体微阵列分析（CMA）技术和二代测序（NGS）技术[3, 6, 7, 8]等, 各种检测技术都有其优缺点。染色体核型分析技术最早用于检测染色体数目和大片段结构异常, 但对< 5 Mb的畸变检出较为困难。FISH、MLPA和qPCR技术具有操作简单、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点, 其中FISH技术对染色体平衡重排的识别具有独特优势, MLPA可用于检测DNA片段中的甲基化模式, qPCR具有即时定量的特点, 但这三者的检测通量少, 检测周期长, 很大程度上制约其在临床上的运用。CMA技术可在全基因组水平进行扫描, 可检测染色体不平衡的CNV, 尤其是对于检测染色体组微小缺失、重复等不平衡性重排具有突出优势。其缺点是无法检测平衡易位或倒位、异常率小于20%的嵌合体、单基因遗传病、DNA甲基化改变等[9]。NGS技术早期并未用于CNV检测, 而是主要用于SNV和小片段Indel的检测。全外显子测序（whole-exome sequencing, WES）属于NGS的重要类型之一, 也被称为目标外显子组捕获, 是将基因组外显子区域DNA进行序列捕获并富集后进行高通量测序的遗传学分析方法, 是目前性价比极高的高通量测序技术, 广泛用于罕见遗传病的辅助诊断[10]。其缺点是无法识别一些片段的改变。近年随着生物信息学算法的发展, 考虑到外显子上的变异可能更具有致病性, 科研人员也希望通过检测外显子上的CNV来实现一个高效、经济的CNV检测, 很多软件被开发用于WES的CNV分析[10]。Tsuchida等[11]对294个癫痫病家族进行WES和CNV分析, 结果发现在168个致病性SNV/Indel为阴性的癫痫家族中, 致病性CNV检出率高达10.70%（18/168）, 且最小的 CNV长度在10 kb以下。国内文献已有用于诊断罕见遗传病的病例报道[12, 13]。本研究根据患儿临床诊断方向, 并结合家庭经济承受能力, 选择不同的检测方法, 并送至第三方基因检测实验室进行基因检测。涉及的CNV检测方法包括CMA、WES的CNV分析、CNV-seq、qPCR、MLPA等, 内容详见表2。

“ 美国医学遗传学与基因组学学会（The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）遗传变异分类标准与指南” 是目前CNV数据解读的主要参考[14]。ACMG指南对CNV的临床致病性进行评估, 将其分为五大类：“ 致病性变异” “ 可能致病性变异” “ 临床意义不明变异” “ 可能良性变异” 和“ 良性变异” , 其中“ 致病性变异” 和“ 可能致病性变异” 对临床具有诊断意义。“ 临床意义不明变异” 指基于目前医学进展和变异分类证据, 该变异的临床意义尚不明确, 一般不宜用于临床决策, 需仔细结合临床进行评估, 随着医学研究进展, “ 临床意义不明变异” 分类可能会发生动态变化。“ 可能良性变异” 和“ 良性变异” 在正常人群中出现频率较高, 往往和遗传多态性有关。

本研究中患儿以慢性幼年起病为主, 男性与女性发病率大致相同, 共涉及15个病种, 由于染色体异常往往导致多个系统发育异常, 临床症状多种多样, 发病机制复杂, 大多数病例确诊需依赖基因诊断。临床医生应增加对罕见遗传病的认识。对于有生长发育迟缓/智力低下、面容异常和先天畸形的患儿应警惕CNV, 特别是染色体微缺失/微重复综合征的可能。CNV检测是诊断罕见遗传病的重要手段, 可作为基因全外显子测序的补充, 从而在一定程度上提高罕见遗传病的诊断水平。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：谢永慧

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