对于疟疾的检测, 目前常用的诊断方法包括血涂片镜检、应用快速诊断试剂盒（RDT）和分子诊断。血涂片需同时进行厚层和薄层涂片, 然后进行Giemsa染色, 以便在显微镜下识别疟原虫的存在^[10]。然而, 血涂片很耗时, 仅染色过程就需要45 min, 而一名训练有素的显微镜专家仍需要15~30 min才能对一张血片进行显微镜检查^[11]。血涂片镜检的灵敏度一般为寄生虫100~500 个/μ L^[12], 而在一些即将消灭疟疾的国家疟疾流行率很低, 寄生虫通常低于100个/μ L^[13]。此外, 厚层涂片很难识别疟疾的类型, 而薄层涂片如果感染密度低则很难确认诊断。虽然RDT比镜检更便宜、更快, 结果可在20 min内确认, 但灵敏度（寄生虫200个/μ L左右)被证实低于其他诊断方法^[14]。比利时一项研究显示, 大约10%的恶性疟原虫感染患者的寄生虫密度低于100个/μ L , 即在镜检和RDT的检测下限范围外^[15]。聚合酶链式反应（PCR）在疟疾诊断方法中具有最高的灵敏度和特异度, 可以识别疟原虫, 也可以区分不同的物种。然而, PCR循环大约需要3 h, 需要具有热循环能力的昂贵设备和熟练的专业人员^[10]。因此, 为了克服这些限制, 本研究建立了一种RAA等温扩增技术检测疟原虫的分子诊断方法。

RAA是一种新的等温扩增技术, 具有快速、简便、成本低等优点, 非常适合临床应用。在该方法中, 重组酶（来自大肠杆菌）和引物形成一个蛋白质-DNA复合体, 可以与双链DNA靶标中的同源序列结合。一旦引物定位到同源序列, 就会发生链式交换反应, 形成并启动DNA合成, 模板上的靶区将被指数级扩增。扩增过程在恒温条件下（一般为37~42 ℃）15~ 30 min内即可完成^[16]。本研究中建立的RAA疟原虫检测方法在37 ℃恒温条件下20 min完成, 与其他方法相比, 显著节省了周转时间。

近年来, 针对疟原虫检测中应用较为广泛的主要有LAMP和RPA, 但这两种技术本身存在的缺点限制了其进一步发展。一套LAMP体系中包含6条引物, 引物设计要求较高且容易引起引物自身的非特异性结合。多重引物还会增加引物在总反应体系中的总量, 也会导致误诊^[5]。最重要的是LAMP产物经琼脂糖凝胶电泳检测呈梯度条带, 不易与特异性扩增区分^[17]。RPA技术的缺点主要在于引物的设计和筛选复杂、引物和探针较长, 无法检测短核酸序列、琼脂糖凝胶电泳检测时, 必须对产物进行纯化等^[18]。目前国内外关于RAA技术应用疟原虫检测的研究虽然已有报道^[17], 但未对不同种类的疟原虫检测能力进行评估。本研究建立的RAA检测体系, 对标准质粒的检测下限为 10^-2 copies/μ L, P.f、P.v和P.o为10² copies/μ L, P.m为10 copies/μ L。研究表明, 每一个间日疟原虫和卵形疟原虫有4~8 copies 18S rRNA ^[19], 因此估算本研究中建立的RAA检测体系检测灵敏度约为：标准质粒0.001 25~0.002 5个/μ L, P.f 、P.v和P.o寄生虫载量12.5~25 个/μ L, P.m：1.25~2.5个/μ L。由于疟疾寄生虫血症血液中寄生虫载量为1 000个/μ L^[20], 因此本RAA体系可适用于临床诊断。2016年, 郑伟等^[17]针对疟原虫18S rRNA基因组序列, 设计了检测疟原虫的通用引物, 并采用RAA技术成功建立了疟原虫的检测方法, 但未对该方法的灵敏度和特异度进行评价。此后郑伟等^[21]又在RAA的基础上设计了实时荧光检测, 最低可检测到100 copies的阳性质粒。相比之下, 本研究所建立的RAA体系在灵敏度、特异度以及操作简便性上均有提升。在Moonga等的研究中^[1], 使用LAMP法对疟原虫线粒体细胞色素b基因进行检测, 并比较了单一和多重LAMP的灵敏度, 结果显示多重LAMP对混合靶标的灵敏度（1 000 copies/μ L）比单一靶标模板（100 copies/μ L）低10倍, 差异可能归因于多重反应中试剂对于混合目标模板的竞争性。Barazorda等^[22]比较了基于实时荧光和孔雀石绿[a malachite-green (MG)-based]的两种LAMP技术对间日疟原虫和恶性疟原虫检测的性能差异, 结果显示两种方法对属特异性的最低检测限均为寄生虫载量2.5个/μ L, 对恶性疟原虫和间日疟原虫的最低检测限分别为寄生虫载量5个/μ L和10 个/μ L。另一项研究使用商品化疟疾试剂盒分别与聚合酶链式反应热循环仪和非仪表式核酸扩增（NINA）平台加热器相结合的研究发现, 间日疟原虫的最低检测限为寄生虫载量5个/μ L和 1个/μ L^[23]。而使用同样的LAMP试剂盒与超快速提取方法相结合, 检测限为寄生虫1个/μ L, 而当仅用于卵形疟原虫感染样本时, 检测限可达到寄生虫0.8~ 2个/μ L^{[24, 25]}。在使用RPA检测诺氏疟原虫的研究中, 最低检测限为1个拷贝的标准质粒且特异性良好^[26]。另一项针对恶性疟原虫28S rRNA基因的RPA结合侧向流动试验超灵敏检测研究中表明^[27], 基于Logistic回归模型, RT-RPA检测下限为每毫升64个寄生虫（95%置信区间）, 在无症状者的筛查中, 特异度可达到90%。以上研究说明, 针对不同靶基因的不同等温扩增技术在灵敏度和特异度上仍有很大差异。本课题组前期已建立了荧光定量PCR技术检测疟原虫的方法^[9], 虽灵敏度较本RAA检测方法更高, 但前者仅PCR程序就要耗时2 h左右, 加之所需试剂和实验仪器较为复杂, 在资源条件相对不足的偏远地区, RAA方法操作更方便、快捷和经济; 如果与荧光探针或者试纸条结合, 可以实现可视化检测。因此, 在消除疟疾的大背景下, 优化现有方法、开发灵敏度更高、操作更简便的检测技术用于资源匮乏和经济欠发达地区是研究的主要方向。

本研究建立的RAA检测方法以其他6种输血传播寄生虫核酸为模板进行验证, 结果表明未产生交叉反应; 对可能来自疟原虫流行区的外籍献血者标本进行了筛查, 结果与荧光定量PCR的检测结果完全一致, 说明本方法具有良好的特异度, 可有效避免漏诊和误判。RAA检测方法不需要复杂的实验室环境、昂贵的设备, 甚至可以用便携式设备来实现, 其运行成本也比荧光定量PCR等方法低。后续若再结合简单的DNA提取方法以及可视化辅助手段, 将会在一些初级诊断实验室中具有较高的应用价值, 给基层偏远医院的临床检测和治疗提供很大的帮助。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：王佳燕