引用本文
陈骑, 张雅曦, 詹森林, 张明霞, 方木通, 李国保, 杨倩婷. 基于CD161的流式检测技术在艾滋病合并结核诊断效能的评价[J]. 中国热带医学, 2022,22(8): 703-706.
CHEN Qi, ZHANG Ya-xi, ZHAN Sen-lin, ZHANG Ming-xia, FANG Mu-tong, LI Guo-bao, YANG Qian-ting. Diagnostic efficiency of CD161 detected by flow cytometric of patients with AIDS complicated with tuberculosis[J]. China Tropical Medicine, 2022,22(8): 703-706.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.08.02
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基于CD161的流式检测技术在艾滋病合并结核诊断效能的评价
陈骑, 张雅曦, 詹森林, 张明霞, 方木通, 李国保, 杨倩婷*
深圳市第三人民医院肝病研究所,广东 深圳 518112
*通信作者：杨倩婷,E-mail：569203197@qq.com

作者简介：陈骑（1990—）,男,本科,主管技师,研究方向：结核病基础免疫相关的分子标识研究。张雅曦（1986—）,女,本科,研究员实习员,研究方向：结核病基础免疫相关的分子标识研究。#张雅曦同为第一作者

收稿日期: 2022-01-14
基金资助: 国家科技重大专项（No.2017ZX10201301-001）
摘要

目的 评价基于CD161的流式检测技术在艾滋合并结核感染中的应用价值。方法 用流式检测技术分别检测58例结核病患者（TB）,55例艾滋病合并结核病患者（HIV+TB）,122例艾滋病患者(HIV)及138例健康对照（HC）全血中CD161的表达水平;同时比较CD161流式检测技术、GeneXpert、TB-DNA、γ-干扰素释放试验（IGRAs）和AFB在TB-HIV中的检测阳性率。结果 TB外周血中淋巴细胞和CD161的表达水平显著低于HC,相反TB中单核细胞和 OR值高于HC,但不受HIV感染影响。当 OR阈值＞0.45时,分辨HC与TB-HIV时,AUC为0.91,灵敏度92.73%,特异度84.06%。在分辨TB和HC时,AUC为0.86,灵敏度74.14% ,特异度82.61%。平行比较AFB、TB-DNA、GeneXpert、IGRAs、CD161检测方法的HIV-TB阳性率,分别为20%、40 %、54.5%、38.1%和92.7%。当HIV-TB的CD4＜100 个/μL时上述5个检测技术的阳性率分别为26%、39.1%、60.8%、30.4%和82.6%。CD4≥100 个/μL患者组检出率分别为15.6%、37.5%、50%、43.7%和100%。结论 流式CD161技术在检测活动性结核及合并艾滋病中具有很好的临床诊断应用价值。

关键词: 艾滋病合并结核病患者; CD161; GeneXpert; γ-干扰素释放试验; 痰涂片
中图分类号:R521.1 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2022)08-703-04
Diagnostic efficiency of CD161 detected by flow cytometric of patients with AIDS complicated with tuberculosis
CHEN Qi, ZHANG Ya-xi, ZHAN Sen-lin, ZHANG Ming-xia, FANG Mu-tong, LI Guo-bao, YANG Qian-ting
Institute of Hepatology, Shenzhen Third People's Hospital, Shenzhen, Guangdong 518112, China
Corresponding author: YANG Qian-ting, E-mail: 569203197@qq.com
Abstract

Objective To study the clinical significance of flow CD161 in HIV with tuberculosis infection, and compare the differences between different detection methods.Methods The expression levels of CD161 in whole blood in 58 cases of tuberculosis patients (TB), 55 cases of HIV-associated TB patients (HIV+TB), 122 cases of AIDS (HIV) and 138 cases of healthy control (HC) were measured by flow assay. The positive rates of CD161, GeneXpert, TB-DNA, Interferon gamma release test (IGRAs) and AFB were compared.Results The expression levels of lymphocytes and CD161 in peripheral blood of TB were significantly lower than HC, while monocytes and OR values of TB were higher than HC, but were not affected by HIV infection. When the OR threshold was greater than 0.45, to distinguish between HC and TB-HIV, the AUC was 0.91, the sensitivity was 92.73%, and the specificity was 84.06%. To distinguish between TB and HC, the AUC was 0.86, the sensitivity was 74.14%, and the specificity was 82.61%. The positive rates of AFB, TB-DNA, GeneXpert, IGRAs and CD161 in HIV-TB were 20%, 40%, 54.5%, 38.1% and 92.7%, respectively. When the CD4 count of HIV-TB was less than 100 /μL, the positive rates of the above five detection techniques were 26%, 39.1%, 60.8%, 30.4% and 82.6%, respectively. The detection rates of CD4≥100 /μL patients were 15.6%, 37.5%, 50%, 43.7% and 100%, respectively.Conclusions CD161 detected by flow cytometric can distinguish active tuberculosis and HIV co-infection. It could be useful to diagnosis of TB tuberculosis and HIV co-infection.

Keyword: HIV and TB co-infection; CD161; GeneXpert; IGRAs; AFB

结核病在传染性疾病中死亡排名第一位[1]。艾滋病患者由于免疫功能低下, 结核分枝杆菌感染是艾滋病机会感染的主要病原之一。因此, 艾滋病患者的早期诊断对结核病及艾滋病疫情的防控有重要的意义[2, 3]。然而, 目前对艾滋病合并结核病的诊断并不理想, 缺乏高效率检测手段, 漏诊导致死亡率高。在艾滋病患者中, 结核感染诊断主要是依靠免疫方法, 其中应用较为广泛的是结核菌素（PPD）皮试, 但是该方法的与卡介苗有交叉反应, 引起的假阳性率较高[4]。另外一种是γ -干扰素释放试验（interferon-γ release assays, IGRAs）技术, 其灵敏度优于PPD试验, 但是还不能排除由于艾滋病患者自身免疫缺陷引起的假阳性结果[5]。为此, 本研究通过前期探索人类免疫系统中的粘膜相关恒定T（MAIT）细胞在肺结核感染中具有抵抗和消耗的重要作用。MAIT细胞是免疫系统的一部分, 其主要任务是控制细菌在身体的屏障, 如皮肤和粘膜。此外, MAIT细胞在抵抗肺部细菌感染（如肺结核）方面有重要作用。然而, 即使是病毒感染, MAIT细胞也会在HIV感染期间做出反应。这可能是因为受感染个体的免疫系统在受感染时失去了对细菌的控制, 在针对这两种病原体的免疫反应中发挥保护作用的能力[6]。CD161是一种C型凝集素样受体, 广泛表达在淋巴细胞上, 包括CD4+、CD8+、NK细胞和MAIT等。因此, 我们前期建立流式技术检测CD161的表达水平, 初步用于分辨结核潜伏感染者和活动性结核患者[7]。本项目希望通过观察艾滋病合并结核病患者的表达差异, 评估该方法在诊断艾滋病合并结核病的效能, 同时与目前实验室结核病诊断方法的平行对比, 评估该方法在临床使用的可能性。

1 对象与方法
1.1 研究对象

1.1.1 艾滋病合并结核病患者组 55例艾滋病合并结核病患者（HIV and TB co-infection, HIV+ TB）收集来自深圳市第三人民医院, 其中男41例, 女14例, 年龄（39.80± 2.45）岁。根据临床症状、胸部X线、AFB、痰或肺泡灌洗液结核菌培养及抗结核药物治疗的反应等表现诊断活动性结核; 同时HIV抗体、HIV-RNA、T细胞亚群检测及市疾控中心确诊为艾滋病患者。所有患者均接受正规抗逆转录病毒疗法（ART）, 初治未进行抗痨治疗。

1.1.2 结核病患者组 58例活动性结核病（tuberculosis, TB）来自肺部医学部住院患者, 男41例, 女17例。年龄（50.03± 1.05）岁。经胸部CT检查、AFB、GeneXpert、痰或肺泡灌洗液结核菌培养及对抗结核药物有改善等临床症状的活动性结核; 患者均初治未接受抗痨治疗。

1.1.3 健康对照组 138例健康对照（healthy controls, HC）收集来自体检中心, 男90例, 女48例。年龄（45.04± 2.13）岁, 均经胸部X线或CT检查, 排除肺部结核及肺外部位结核。既往无结核史, 无结核接触史, 无服用过抗结核药物。

1.1.4 艾滋病组 122例艾滋病患者（HIV-infected, HIV）来自感染科住院患者, 男109例, 女13例, 年龄（36.41± 1.04）岁, 经胸部CT检查、痰一般细菌培养、AFB、血常规等临床体征, 排除结核菌感染的肺部炎症患者。均接受正规ART治疗, 无结核史及抗结核药物使用史。

1.2 试剂与仪器

AFB抗酸染色试剂（BasoC20050 1）购自珠海贝索生物技术有限公司; TB-DNA核酸检测（货号：20200801）试剂购自达安基因股份有限公司, PCR仪器型号ABI-7500。GeneXpert检测试剂盒（货号：1000166969）购自代理公司深圳市同春和生物科技有限公司, 仪器购自美国赛沛公司全自动荧光定量PCR仪Cepheid 工作站; IGRAs试剂盒（货号：20200600905）购自北京同生时代生物科技有限公司, 斑点Elispot读板仪购自美国CTL公司; 流式CD161试剂盒（货号：20200501）购自深圳市联合医学科技有限公司, 细胞流式仪CantoⅡ 购自美国BD公司。上述检测严格按照是要说明书进行操作。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 所有研究对象都随机（未输液）采用EDTA-k2抗凝管采集外周血用于流式细胞仪检测CD161, T细胞亚群和HIV抗体检测。活动性结核及合并艾滋病感染患者收集多次清晨痰液样本, 进行痰涂片、TB-DNA、GeneXpert等检测。

1.3.2 流式细胞染色 取100 μ L EDTA抗凝全血用抗 CD3（BD Bioscience, SY7）、抗 CD45（BD Bioscience, 2D1）、抗 CD64（Beckman Coulter, 1604U）和抗CD161（Beckman Coulter, 191B8）等抗体进行表面染色, 室温避光孵育20 min后, 用红细胞裂解液（BD Bioscience）将红细胞裂解, 离心后收集细胞, 用PBS洗涤2次重悬进行流式分析。

1.3.3 流式结果分析 流式结果用软件FlowJo进行分析, 分别圈出单核细胞（CD45+ CD64+）、淋巴细胞（CD45+ CD64-）、CD161+细胞（CD45+ CD64- CD161+）, 最后得出单核细胞比例、淋巴细胞比例和表达CD161+细胞比例[7]。结核病可能值（OR）值计算为公示为：粒细胞百分比/（单核细胞+淋巴细胞百分比）× CD161百分比。

1.4 统计学分析

数据统计均应用Prism v7（GraphPad, CA, USA）软件进行统计分析。计量资料用x± s表示, 采用非配对t检 验计算两组间差异; 利用参数ROC曲线分析敏感性和特异性。当P< 0.05时差异有统计学意义。

2 结果
2.1 艾滋病合并结核病患者全血中CD161的表达水平

利用流式检测不同人群外周血CD161的表达水平, 结果发结核病患者淋巴细胞（71.25± 2.04）%和CD161的表达水平（31.64± 1.53）%低于健康对照, 分别为（83.47± 0.43）%和（35.68± 1.03）%, 相反单核细胞的表达水平则结核病患者（25.68± 1.96）%高于健康对照（14.65± 0.42）%。

通过淋巴细胞比例, 单核细胞比例和CD161比例运算的OR值在四组人群中的比例分别为：健康对照（0.282± 0.261）%、结核病患者（0.720± 0.279）%、艾滋病患者 （0.293± 0.246）%和艾滋病合并结核病患者（0.803± 0.226）%。结核病患者组和艾滋病合并结核病患者组OR值高于健康对照组或艾滋病患者组, 分别与健康对照组和艾滋病患者组比较差异有统计学意义（P < 0.01）。结果显示通过OR值运算能分辨活动性结核和其他人群。见表1。

表1 各组人群中细胞表达水平比例差异 Table 1 Proportion difference of cell expression levels in each group
2.2 CD161流式检测方法在鉴别结核病的效能

通过绘制ROC曲线验证流式CD161检测分辨艾滋病合并结核病患者组和健康对照组的效能。结果显示, 利用OR值分辨健康对照与合并HIV结核病患者时, AUC（area under curve）为0.91。当OR阈值 > 0.45时, 灵敏性92.73% （95% CI 82.41%~97.98%）, 特异度84.06%（95% CI 76.86%~89.73%）。在分辨活动性结核病患者和健康对照OR阈值 > 0.45时, AUC为086, 灵敏性74.14%（95% CI 60.96%~84.75%）, 特异度82.61%（95% CI 75.24%~88.53%）。见表2。

表2 CD161在不同人群中的诊断效能比较 Table2 Comparison of diagnostic efficacy of CD161 in different populations
2.3 流式CD161检测方法与其他结核筛查检测方法比较

其中运算OR值以0.45为阈值判断在健康对照、艾滋病患者、结核病患者、艾滋病合并结核病患者中的阳性预测结果分别为17.3%、13.9%、74.1%、92.7%。比较不同不同检查方法和CD161检测在鉴别结核病患者中分析阳性率分别为34.1%（AFB）、70.6%（TB-DNA）、87.9%（GeneXpert）、81%（IGRAs）和74.1%（CD161）。不同检测方法在艾滋病合并结核病患者中的诊断效率分别为20%（AFB）、40%（TB-DNA）、54.5%（GeneXpert）、38.1%（IGRAs）和92.7%（CD161）。见表3。

表3 不同方法学的活动性结核的效率比较 Table 3 Comparison of the efficiency for diagnosis of active tuberculosis by different methods
2.4 艾滋病合并结核病患者的CD4细胞数量对不同方法的影响

根据CD4细胞数量进一步将55例艾滋病合并结核病患者为CD4 < 100 个/μ L患者组（23例）和CD4≥ 100 个/μ L患者组（32例）。然后比较AFB、TB-DNA、GeneXpert、IGRAs、CD161检测方法的阳性率。CD4 < 100个/μ L患者组阳性率分别为26%、39.1%、60.8%、30.4%和82.6%。CD4≥ 100 个/μ L患者组检出率分别为15.6%、37.5%、50%、43.7%和100%。CD161不同CD4细胞数量不影响CD161检测阳性率。见表4。

表4 不同CD4细胞数量对不同检测方法结果的影响 Table 4 Effects of different CD4 cell counts on the results of different detection methods
3 讨论

结核分枝杆菌感染是艾滋病患者最常见的感染性疾病, 也是艾滋病患者死亡的主要原因之一。我国属于结核病高发地区, 结核病合并艾滋病患者的临床症状并不典型, 这使得目前的临床诊断十分困难[1]。艾滋患者合并结核病确诊的方法还是微生物学检查, 包括痰或组织标本找抗酸菌, 结核分枝杆菌培养和PCR核酸检测。但临床上相当部分的患者没有办法留取痰标本, 受到痰样本的限制。在能获得痰标本的病例中, 即便是水平较高的医院, 抗酸染色和细菌培养检查的阳性率仅约为40%[8, 9]。且菌种鉴定和药敏试验等检测, 其需要1~2个月, 很多患者已经开始治疗2个月, 甚至更长时间才能获得结核菌培养结果。

细胞免疫检测包括PPD皮试和IGRAs技术, 主要用于结核菌感染的诊断。PPD皮试是目前检测结核菌感染最常用的细胞免疫检查方法, 虽然操作简单, 但患者需要在皮试后72 h查验, 最主要的是PPD皮试所用抗原与BCG有交叉反应。利用免疫学检测目前最好的检测方法是IGRAs技术, 其敏感性是现有的诊断技术中最高的[10]。然而, IGRAs检测无法有效区分活动性结核和结核菌潜伏感染。对于艾滋病引起的自身免疫反应紊乱, IGRAs的诊断效率更为有限[11, 12]。

为了提高结核病诊断的准确性, 我们前期研发了CD161流式检测技术, 用于结核病的辅助诊断[7]。CD161 (NKR-P1A)属于C型凝集素超家族, 表达在天然的NK细胞和T细胞上。CD161表达在记忆性/功能性CD4+T 细胞、CD8+T细胞、TCRγ t T细胞、部分CD3+胸腺细胞和Th17 CD4+T细胞[7, 13]。与前期的研究发现一致, 本研究发现CD161在结核病患者中显著低于健康对照。然而艾滋病是否也影响CD161的表达, 目前还没有相关报导, 为此, 纳入了艾滋病患者的队列。结果表明健康人群与艾滋病患者比较, CD161的表达水平并没有差别。同样, 艾滋病合并结核病患者, CD161的表达水平显著低于健康对照和艾滋患者。此外, 本研究合并淋巴细胞、单核细胞和CD161的比例, 计算出OR值。观察到在健康对照中HIV感染并不影响OR值。再有, 利用OR值能有效的区分结核病患者和健康对照, 在分辨艾滋病合并结核病患者及结核病患者时, 灵敏度为92.73% , 特异度84.06%。

CD161检测方法与目前结核诊断的常用方法比较, 在诊断结核的阳性率显著高于其他4种检查方法。另外, 由于艾滋病会严重紊乱机体的免疫系统, 最重要的表现是CD4T细胞的下降, 这会使得免疫相关的检查结果不准确[14, 15]。IGRAs在艾滋病合并结核病患者的阳性率只有38.1%, 但CD161检查阳性率为92.7%。而且, 当CD4T 细胞低于CD4 < 100 个/μ L时, IGRAs的阳性率显著下降为30.4%, 但CD161检测的阳性率显著高于IGRAs, 为82.6%。这结果提示CD161检测的结果并不受细胞数量及机体的免疫状态影响, 有利于在免疫功能紊乱的患者中开展。

当然, 本研究部分人群中的观察, 下一步将通过多中心的大样本验证。总之, 本研究提供了一个简单、快捷的、可用于艾滋病合并结核病患者的辅助诊断的检测方法。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：邢翀

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