目前常用的等温技术包括链替代扩增反应（strand displacement amplification, SDA）、依赖核酸序列等温扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、依赖解旋酶DNA等温扩增技术(helicase-dependent isothermal DNA amplification, HDA)、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）和重组酶介导的等温扩增技术（recombinase-aided isothermal amplification assay, RAA）, 其中LAMP、RPA和RAA相对成熟（表1）。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 几种常见的等温核酸扩增技术比较 Table 1 Comparison of several common isothermal nucleic acid amplification techniques 方法 Techniques 模板Templates 温度Temperature /℃ 扩增时间Amplification time/min 引物数量 Primers No. 酶 Enzymes 是否预热Pre-heating 检测方式 Test method PCR DNA/RNA 温度梯度 120~180 2 DNA聚合酶 是 凝胶电泳实时荧光 NASBA RNA 42 90~120 4 RNaseH、RNA聚合酶、AMV逆转录酶 是 凝胶电泳实时荧光浊度 SDA DNA 37 120 4 限制性内切酶、DNA聚合酶 是 凝胶电泳实时荧光 HDA DNA 65 < 120 4 解旋酶、聚合酶 否 凝胶电泳实时荧光测流试纸条 LAMP DNA 60~65 < 60 4~6 Bst DNA聚合酶 否 凝胶电泳实时荧光浊度 RPA DNA/RNA 25~42 5~20 2 重组酶、聚合酶 否 凝胶电泳实时荧光测流试纸条 RAA DNA/RNA 37~42 5~20 2 重组酶、聚合酶 否 凝胶电泳实时荧光测流试纸条

表1 几种常见的等温核酸扩增技术比较 Table 1 Comparison of several common isothermal nucleic acid amplification techniques

1.5 重组酶聚合酶扩增技术（RPA）

RPA作为一种新兴的体外核酸等温扩增技术, 其扩增模板序列既可以是DNA, 也可以是RNA, 主要反应原理类似T4噬菌体核酸复制。RPA反应中需要能与寡核苷酸引物结合的重组酶、单链DNA结合蛋白（single strand DNA-binding protein, SSB）、链置换DNA聚合酶以及1对引物^[18]。RPA反应体系原理如图1^[19]。

图1

Fig. 1

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图1 RPA反应原理 A.重组酶与引物结合形成复合物, 并在模板上锚定靶点; B.复合物识别同源序列, 在重组酶的作用下DNA双链解开, 并发生链置换反应形成D-Loop结构, 然后SSB与被置换的单链DNA结合使其不能再被置换; C.重组酶分解后, 暴露出3'-端的引物被DNA聚合酶识别, DNA开始扩增; D. 在引物延伸期间, 模板DNA在链置换DNA聚合酶作用下继续解螺旋, 并进行扩增; E.形成两个完整的扩增子。Fig. 1 Reaction principle of RPA A. Recombinant enzymes bind to primers to form complexes and anchor targets on the template; B. The complex recognizes the homologous sequence. The DNA double strand unravels in the presence of recombinase and undergoes a strand-swap reaction to form a D-Loop structure, and then the SSB binds to the displaced single-stranded DNA so that it cannot be replaced again; C. After recombinase disassembly, the primer at the 3'-end is exposed and recognized by DNA polymerase and the DNA begins to amplify; D. During primer extension, the template DNA continues to unwind and amplify in the presence of strand-substituting DNA polymerase; E. Formation of two complete amplicons.

与PCR相比, RPA的反应温度一般为 37~39 ℃, 不需要经过高温变性、低温退火这两步, 因而反应时间更短, 只需要20~40 min, 然后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 因此RPA更接近于真正意义上的等温扩增^[20]。RPA 反应只需要简易的恒温装置, 如水浴锅等, 甚至可以在人体体温条件下进行反应, 并不需要PCR扩增中所使用的热循环设备以及大量的电力支持。鉴于其成本低廉, 更加适合特殊条件下的快速检验。近年, 国内有团队报道了将DNA提取、多重数字RPA和荧光检测结合于一体的微流控芯片, 无需其他仪器即可快速准确检测病原体^[21]。

目前, 已有诸多运用等温扩增技术进行寄生虫检测的报道, 尤其是LAMP、RPA和RAA法, 取得了较好的应用效果。以LAMP法为例, Inomata等^[23]基于隐孢子虫的18S rRNA建立的RT-LAMP分析方法对水体的隐孢子虫进行检测, 检测限低至6× 10-3个卵囊/试管。Kumagai等^[24]以日本血吸虫的28S rDNA所建立的LAMP方法, 最低阳性检出值为100 fg。陈曦等^[25]针对疟原虫线粒体DNA基因设计了疟原虫属的LAMP检测试验, 与巢氏PCR检测相比表现良好（95%CI灵敏度98.48%~100%, 特异度90.75%~100%）。张艳艳等^[26]基于Cox2基因建立的细粒棘球绦虫LAMP检测方法, 阳性结果相较常规PCR法具有高特异度和高灵敏度。

以RPA法为例, Sears等^[27]设计了一种检测广州管圆线虫的RPA方法, 检测限低至1 fg/μ L, 并实现在人体体温条件下进行扩增。Alalremruata等^[28]将等温逆转录-重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）和侧向流动分析结合, 应用于对低密度恶性疟原虫的检测。Khan等^[29]使用定量RPA方法对杜氏利什曼原虫进行检测, 表明该法在资源相对匮乏的情况下, 仍具有监测寄生虫血症的能力。

以RAA法为例, 以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标所构建并优化的RAA荧光反应体系, 最低可检出的质粒浓度为10² copies/μ L^[30]; 以日本血吸虫G28（SjG28）基因片段作为检测靶标建立的荧光RAA反应体系, 最低可检出的质粒浓度为 10 copies/μ L^[31]; 以细粒棘球绦12S rRNA基因序列作为检测靶标所构建的细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法, 最低可检测出0.1 ng/μ L细粒棘球绦虫基因组DNA样本和10 copies/μ L含靶序列的重组质粒DNA^[32]。

相比之下, LAMP、RPA和RAA都具有较高的敏感性, 但LAMP法需要在65 ℃条件下扩增 60~80 min后, 80 ℃ 5 min终止反应, 所需温度高, 耗时较长; 而RAA只需在37 ℃ 10~20 min内即可检测完成。近几年比较热门恒温检测方法当属RPA和RAA法, 特别是后者, 已经被运用到多种寄生虫如吸虫的诊断中, 部分寄生虫的阳性检出时间、重组质粒最低检测值、DNA荧光信号最低检测值和检测分子标靶^[33]见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 RAA技术在寄生虫检测领域的应用 Table 2 Application of RAA technology in parasite detection 寄生虫 Parasite 反应温度 Reaction temperature/℃ 扩增时间 Amplification time/min 灵敏度 Sensitivity/( copies· μ L-1) DNA荧光信号最低检测值Minimum detection value of DNA fluorescence signal 分子靶标 Molecular targets/bp 参考文献 Reference 曼氏血吸虫S. mansoni 39 5 10 0.1 fg/μ L 121 [34] 细粒棘球绦虫Echinococcus granulosus 39 6 10 0.1 ng/μ L 391 [32] 华支睾吸虫Clonorchis sinensis 39 10 10 3 pg/μ L 223 [35] 蓝氏贾第鞭毛虫Giardia duodenalis 39 10 100 1 pg/μ L 205 [36] 广州管圆线虫Angiostrongylus cantonensis 37 5 10 100 pg/μ L 174 [37] 日本血吸虫Schistosoma japonicum 37 5~10 10 10 copies/μ L 162 [31]

表2 RAA技术在寄生虫检测领域的应用 Table 2 Application of RAA technology in parasite detection

表2中可以看出, 对于这些寄生虫来说, RAA能实现的检测时间均在10 min以内, 且检测灵敏度相对较高, 对于重组质粒来说, 最低检测值达到10~100 copies/μ L, DNA最低检测值达到0.1 fg/μ L~0.1 ng/μ L之间。因此, RAA用于寄生虫病的检测具有广阔的应用前景, 但目前尚未有RAA用于疟原虫的检测。

当前, 运用疟原虫检测的等温扩增技术仅局限在LAMP法, 尚未有RPA或RAA等方法的相关报道。例如, Han等^[38]根据18S rRNA基因建立了4种人体疟原虫的LAMP检测法, 在平均26 min内完成疟原虫属检测, 在68份显微镜阳性血样中的67份（灵敏度98.5%）和53份显微镜阴性血样中的3份（特异度94.3%）中检测到疟原虫, 接近巢氏PCR结果而用时更短。王真瑜等^[39]根据间日疟原虫CSP基因建立了检测间日疟原虫的 LAMP方法, 灵敏性与多重PCR法相当, 而特异性略低。Poon等^[40]建立了基于疟原虫小亚基核糖体基因进行LAMP检测的方法, 灵敏度和特异度分别可以达到巢式PCR的95％和99％。

随着分子生物技术的发展, 等温核酸扩增技术发展为便携式分子诊断发展的理想候选技术。目前疟原虫分子诊断主要依靠传统的PCR技术, 但是PCR需要热循环扩增仪进行热变步骤, 造成PCR成本相对较高, 不适于现场环境下的快速检测。相比较而言, 各种等温扩增技术简便、快速、高效, 有可预见的良好应用前景。其中, 新发展的PRA与RAA技术克服了传统等温扩增技术反应时间漫长的缺陷, 也具有无需特定目标基因选择的优势。但也有不可避免的不足之处, 如在恒定温度下的扩增反应难避免的引物的非特异性结合出现的假阳性问题。尽管如此, 应用RPA和RAA技术筛选高特异性的关键酶, 将会在简便条件下的疟原虫检测方面普及应用。

苏州先达研发的酶促重组酶快速扩增技术（enzymatic recombinase amplification, ERA技术）, 利用抗体制药领域的先进技术手段, 将来源于细菌、病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能, 通过不同的DNA扩增反应体系进行优化组合, 从而获得核心的重组等温扩增体系, 研发出具有自主知识产权的酶促重组酶快速扩增方法, 该方法在低温条件下（25~42 ℃）可对痕量的靶DNA片段进行特异性扩增, 在最适温度35~40 ℃时, 扩增反应时间仅需15 min, 其低温适应性和灵敏性等方面相比进口RPA技术产品有了新的突破, 而且摆脱美国专利壁垒。目前, 该方法现已被海军军医大学相关专家团队应用于其他病原体核酸的快速检测研究, 并已取得良好的应用效果。因此, 重组酶等温扩增技术具有潜在的、巨大的市场应用前景。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：王佳燕