引用本文
杨毅, 陈国利, 孙高峰, 杨艳梅, 尚月梅, 官蕾, 牟文婷. 一起弗劳地柠檬酸杆菌引起的食物中毒病原鉴定及耐药性分析[J]. 中国热带医学, 2023,23(1): 94-97.
YANG Yi, CHEN Guo-li, SUN Gao-feng, YANG Yan-mei, SHANG Yue-mei, GUAN Lei, MU Wen-ting. Etiologic identification and drug susceptibility analysis of a Citrobacter freundii food poisoning event [J]. China Tropical Medicine, 2023,23(1): 94-97.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2023.01.17
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一起弗劳地柠檬酸杆菌引起的食物中毒病原鉴定及耐药性分析
杨毅, 陈国利, 孙高峰*, 杨艳梅, 尚月梅, 官蕾, 牟文婷
乌鲁木齐市疾病预防控制中心,新疆 乌鲁木齐 830000
*通信作者：孙高峰, E-mail: sgfxj2004@126.com

作者简介：杨毅（1981—）,男,硕士,副主任技师,研究方向：病原微生物学。

收稿日期: 2022-02-17
基金资助: 国家重点研发项目（No. 2017YFC0907203）
摘要

目的 对一起突发食物中毒事件进行病原检测及耐药性分析,为突发食物中毒事件的应急处置提供参考。方法 对采集的样本按照GB 4789等标准方法进行致病菌检测,分离株采用VITEK2和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行菌株鉴定,同时采用微量肉汤稀释法进行细菌药物敏感性试验,并对不同来源分离株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型,以BioNumerics软件分析菌株之间的相关性。结果 13份剩余食物和3份腹泻患者粪便经分离鉴定,有7份剩余食物样本的菌落总数、大肠菌群全部超标,有5份剩食物和2个病例的粪便中检出弗劳地柠檬酸杆菌,药敏试验结果显示,7株弗劳地柠檬酸杆菌对环丙沙星、四环素、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、头孢噻肟和美罗培南均敏感,但对氨苄西林完全耐药,无多重耐药现象;检出的7株弗劳地柠檬酸杆菌,经脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测结果为：7株弗劳地柠檬酸杆菌的PFGE条带一致、同源性100%,显示为同一克隆。结论 本起食物中毒事件是由弗劳地柠檬酸杆菌导致的,通过飞行质谱方法可以快速、准确确定食物中毒的病原,利于感染性疾病的早期诊疗,建议加大相应的管理力度,提高食品安全意识,预防类似事件的发生。

关键词: 食物中毒; 弗劳地柠檬酸杆菌; 脉冲场凝胶电泳; 药敏分析; 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2023)01-94-04
Etiologic identification and drug susceptibility analysis of a Citrobacter freundii food poisoning event
YANG Yi, CHEN Guo-li, SUN Gao-feng, YANG Yan-mei, SHANG Yue-mei, GUAN Lei, MU Wen-ting
Urumqi Center for Disease Control and Prevention, Urumqi, Xinjiang 830000, China
Corresponding author: SUN Gao-feng, E-mail: sgfxj2004@126.com
Abstract

Objective In order to provide reference for emergency treatment of a sudden food poisoning incident, pathogen detection and drug resistance analysis were carried out.Methods Diarrheal stool and surplus food samples were detected by GB 4789 and the isolates were identified by VITEK2 and matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), at the same time, the bacterial drug sensitivity test was carried out by using the method of microbroth dilution, and the isolates from different sources were molecularly classified by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), and the correlation between the strains was analyzed by BioNumerics software.Results Totaly 13 leftovers and 3 diarrhea patients were isolated and identified, The total number of colonies and coliforms in 7 leftovers samples all exceeded the standard, and Citrobacter freundii was detected in 5 leftovers and 2 stools. The results of drug sensitivity test showed that seven strains of Citrobacter freundii were sensitive to ciprofloxacin, tetracycline, chloramphenicol, gentamicin, amikacin, cefotaxime and meropenem, but completely resistant to ampicillin, and there was no multiple drug resistance. The results of pulsed field gel electrophoresis (PFGE) showed that 7 strains of Citrobacter freundii had the same PFGE bands and 100% homology, showing the same clone.Conclusions This food poisoning incident was caused by Citrobacter freundii. The pathogen of food poisoning can be quickly and accurately determined by MALDI-TOF MS, which is beneficial to the early diagnosis and treatment of infectious diseases. It is suggested to strengthen the corresponding management, improve food safety awareness and prevent similar incidents.

Keyword: Food poisoning; Citrobacter freundii; pulsed-field gel electrophoresis; drug resistance analysis; MALDI-TOF MS

弗氏柠檬酸杆菌是“ 人-兽-鱼” 共患的革兰阴性条件致病菌, 动物和人均可感染致病性弗氏柠檬酸杆菌而发生腹泻、食物中毒和继发感染[1]。2021年4月29日, 某市某学校发生一起25人发病的疑似食物中毒, 通过实验室检测, 确定为一起弗劳地柠檬酸杆菌污染引起的食物中毒事件, 现报告如下。

1 材料与方法
1.1 流行病学调查

2021年4月29日午13：30时, 在某市某学校内部食堂学生就餐吃午饭, 饭后2~7 h内, 部分学生陆续出现不同程度临床症状, 表现以恶心、腹痛、腹泻为主。经医院对症治疗后, 所有患者症状缓解, 无危重病例及住院病例。截止当日20：30, 共发病人数25人。患者分别属于不同家庭, 近期无共同进餐史。相关调查工作严格按照伦理委员会要求开展。

1.2 标本采集

对现场13份可疑食物样品：凉拌土豆丝（1号）、水煮花生（2号）、凉拌木耳（3号）、水煮玉米（4号）、馕（5号）、炒西红柿（6号）、凉拌豆腐（7号）、炸酱面（8号）、炒青菜（9号）、炒饭（10号）、炒豆芽（11号）、炒白菜（12号）、凉拌豆腐（13号）; 3名腹泻患者便（14号、15号、16号）, 均送实验室依按GB 4789-2016《食品卫生微生物检验标准》[2]、WS271-2007《感染性腹泻诊断标准》[3]开展大肠菌群、菌落总数、沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、致泻性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、诺如病毒检测。

1.3 主要试剂与仪器

VITEK2 Compact型全自动微生物及药敏分析系统（法国梅里埃）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）, CHEFF-MAPPER 脉冲场凝胶电泳仪（伯乐） 、GEL Doc XR+凝胶成像仪（伯乐）、图谱分析软件（BioNumerics）。各种致病菌检测所需增菌液：BPW、SC、TTB、7.5％氯化钠肉汤、肠道菌增茵肉汤、胰酪胨大豆多粘菌素肉汤、PCA琼脂、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）等均为北京陆桥和广东环凯微产品; 沙门氏菌显色平板、金黄色葡萄球菌显色平板为法国科玛嘉产品, 限制性内切酶Xba Ⅰ （Takara公司）、Seakem Gold（美国Lonza）, 均在有效期限内使用。

1.4 细菌鉴定及药敏试验

对可疑菌株分别采用VITEK2 Compact GN卡和MALDI-TOF MS进行菌株鉴定。药敏试验采用微量肉汤稀释法。试验方法、判读标准和质控要求参照2020年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）文件的规定。微量肉汤稀释法药敏鉴定板包括氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、厄他培南、美罗培南、阿米卡星、阿奇霉素、四环素、复方新诺明、氯霉素、环丙沙星11种抗生素。

1.5 脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型

参照中国疾控中心徐建国团队优化的柠檬酸杆菌PFGE 操作方法[4], 对7株弗劳地柠檬酸杆菌进行分子分型, 挑取适量过夜培养新鲜细菌培养物进行胶块制备、胶块的裂解、酶切（限制性内切酶是Xba Ⅰ ）、电泳（参数：电压梯度6 V/cm, 电泳夹角120° , 电泳温度14 ℃, 初始转换时间1 s, 终末转换时间20 s, 电泳时间19 h）, 成像, 图谱用BioNumerics 软件作数据分析, 绘制聚类分析树状图, 电泳条带位置优化度设置为1.5%, 相似度为100%认定为同一PFGE带型。以沙门菌 H9812 作为统一的分子量标准进行校准。

2 结果
2.1 卫生学指标检测

1号、2号、3号、5号、7号、11号、13号的菌落总数、大肠菌群均超标。3号、4号、5号、6号、9号样品检出弗劳地柠檬酸杆菌5株; 14号、15号患者腹泻物检出弗劳地柠檬酸杆菌2株; 13份食品及3份患者腹泻物均未检出沙沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、致泻性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、诺如病毒可疑致病菌。

2.2 致病菌分离情况

3、4、5、6、9、14、15号样品在SS、XLD平板上分离到可疑致病菌形态中等大小, 光滑湿润, 边缘整齐, 迟缓发酵乳糖, 菌落呈粉红色, 带或不带黑色中心。MALDI-TOF MS微生物鉴定结果为弗劳地柠檬酸杆菌（种水平置信∶ 9.435）; VITEK2 Compact全自动微生物鉴定结果为弗劳地柠檬酸杆菌（鉴定率90%）。

2.3 细菌药物最小抑菌浓度（MIC）值

药敏试验表明（表1）, 7株弗劳地柠檬酸杆菌对氨苄西林耐药, 其余药物均较敏感。

表1 7株弗劳地柠檬酸杆菌药敏试验结果 Table 1 The drug susceptibility test of 7 strains Citrobacter freundii
2.4 菌株PFGE分型

经Xba Ⅰ 酶切、PFGE电泳, 图谱聚类分析, 树状图显示（图1）, 7株弗劳地柠檬酸杆菌基因组的电泳图谱条带数量与位置完全相同, 相似度为100%, 为同一型别。

图1 7株弗劳地柠檬酸杆菌聚类分析图Fig. 1 PFGE patterns of 7 strains of Citrobacter freundii

3 讨论

弗劳地枸橼酸杆菌主要存在于人和动物肠道, 广泛分布于水源、土壤以及被污染的蔬菜瓜果[5]。近年来, 弗劳地柠檬酸杆菌的存在使由其污染食品导致食物中毒, 引起腹泻的报道时有发生[6, 7, 8], 但人源弗劳地柠檬酸杆菌临床分离株的研究少于动物和环境的分离株。在肠道腹泻病监测中偶有遇到在SS培养基迟缓发酵乳糖, 且菌落形态及生化特征与沙门菌相似, 经鉴定为弗劳地柠檬酸杆菌。由于该菌为条件致病菌, 广泛分布于自然界, 一般不被重视, 但在分离的胆道感染病原菌中占前8位[9], 在耐碳青霉烯类肠杆菌分离中占前5位[10], 提示弗劳地柠檬酸杆菌尚未被人们充分认识, 是一种有危害加重趋势的病原菌。本事件中分离到的7株弗劳地柠檬酸杆菌, 其中5株为凉菜、熟食、面食3类食品检出, 2株分离于腹泻患者, 分子分型完全同源。结合流行病学资料、病例临床表现以及实验室检测结果, 本次事件疑是由食用弗劳地柠檬酸杆菌污染的各类食品所致。该菌在新疆地区引起中毒的相关报道尚属首次, 应引起相关部门的重视, 同时笔者建议将弗劳地柠檬酸杆菌纳入食物中毒诊断标准, 为调查和处理公共卫生突发应急事件提供依据。

本次实验采用VITEK2 Compact和 MALDI-TOF MS 两种方法, 可疑菌鉴定均为弗劳地柠檬酸杆菌, MALDI-TOF MS可较VITEK2 Compact提早4~6 h出具报告。MALDI-TOF MS作为近年来微生物鉴定领域最具代表性的技术之一, 该系统虽然存在暂时局限性, 如：不能区分大肠埃希菌和志贺菌属; 可能把一些非致病的奈瑟菌与脑膜炎奈瑟菌混淆等问题[11], 但是更多研究表明：MALDI-TOF MS在沙门菌、金黄色葡萄球菌、产碳青霉烯酶肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌、新型冠状病毒等病原微生物快速鉴定及同源性分析中操作简便, 耗时短且准确率高[12, 13, 14, 15, 16], 有利于感染性疾病早期诊断及溯源。

近年来, 弗劳地枸橼酸杆菌引发的重症患者医院感染已日益严重, 并且碳青霉烯类耐药弗劳地枸橼酸杆菌检出率逐年增加, 多重耐药以及泛耐药弗劳地枸橼酸杆菌已不再罕见[17]。本研究药敏结果显示, 此次引发食物中毒的7株弗劳地柠檬酸杆菌均对氨苄西林耐药, 与冯婷婷等人报道一致[18], 对碳青霉烯类、头孢类、喹诺酮类、氨基糖苷类及β -内酰胺类抗菌药物呈高度敏感, 这一点与中国美罗培南敏感性监测（Chinese meropenem susceptibility surveillance, CMSS）项目报道相符[19, 20]。但不排除随着携带耐药基因的质粒在不同种属细菌间“ 穿梭” , 导致多重耐药以及泛耐药弗劳地枸橼酸杆菌的出现, 此类细菌引起暴发流行的趋势, 值得相关部门引起重视。

PFGE分型法以分辨率高、结果准确可靠, 在识别和追踪细菌引起的食物中毒及医院感染中得到有效的验证[21, 22, 23]。本次事件中粪便、食物样本中分离到的7株弗劳地柠檬酸杆菌PFGE结果显示其带型完全相同, 指纹图谱相似度为100%。认为本次从不同类别样本中分离到的弗劳地柠檬酸杆菌完全同源, 提示这些菌株是同一克隆, 说明在此次食物中毒事件中, 加工操作环节存在持续性同源暴露问题, 强烈建议相关职能部门, 加大集体食堂管理力度, 减少食物中毒发生; 加强食品安全相关知识培训, 提高预防食物中毒意识, 预防类似事件的发生。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：邢翀

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