引用本文
李春缘, 刘炅, 刘纪茹, 胡潇予, 曹孟涛, 陈月, 田靖, 任瑞文, 徐晓立. 基孔肯雅病毒定量反转录聚合酶链式反应绝对定量检测方法的建立[J]. 中国热带医学, 2023,23(2): 121-125.
LI Chun-yuan, LIU Jiong, LIU Ji-ru, HU Xiao-yu, CAO Meng-tao, CHEN Yue, TIAN Jing, REN Rui-wen, XU Xiao-li. Establishment of qRT-PCR for absolute quantitative detection of Chikungunya virus[J]. China Tropical Medicine, 2023,23(2): 121-125.  
Doi: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2023.02.03
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基孔肯雅病毒定量反转录聚合酶链式反应绝对定量检测方法的建立
李春缘1,2, 刘炅1,2, 刘纪茹3, 胡潇予3, 曹孟涛3, 陈月1,2, 田靖1,2, 任瑞文1,2, 徐晓立3,*
1.南部战区疾病预防控制中心,广东 广州 510507
2.广东省虫媒病毒性传染疾病应急技术研究中心,广东 广州 510507
3.华南农业大学测试中心,广东 广州 510642
∗通信作者：徐晓立,E-mail:xuxiaoli@scau.edu.cn

作者简介：李春缘（1989—）,女,博士,助理研究员,研究方向：医学病毒学。

修回日期: 2022-07-08
基金资助: 全军后勤科研项目（No. 17SAZ11,No. 19SWAQ02,No. A3702022003）; 广东省自然科学基金（No. 2022A1515011132）; 广东省医学科学技术研究基金( No. A2016062）
摘要

目的 建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR快检方法,为其实验室诊断与定量分析提供技术方法。方法 基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析,筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列,并以人GAPDH基因为内参照,设计引物、探针,采用L9（34）正交实验确定最佳反应条件,建立基于TaqMan探针法的基孔肯雅病毒qRT-PCR快检方法,并详细分析所建立方法的灵敏度、特异度、重复性及覆盖面。以克隆的检测靶标核酸片段为阳性品,制作标准曲线,建立绝对定量方法。结果 经系统优化,建立了基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR定性、定量检测方法,反应体系包括：基孔肯雅病毒、GAPDH内参照检测引物探针,RT/ Taq酶混合液,反应缓冲液及阴阳性参考品。所建立方法与ECSA亚型ROSS株、IOL分支LR2006株,亚洲型181/25株以及2010东莞流行株均可获得阳性结果,而与所试其他18种黄病毒、甲病毒、布尼安属相近虫媒病毒无交叉反应,检测下限为580 拷贝/mL。定量分析表明,在5.80×102~5.80×1010 拷贝/mL范围内,检测荧光信号值与模板浓度具备良好线性关系,其 R2=0.999 5,扩增效率为E=0.91%。重复性实验表明,定量分析的批内变异系数为0.01~0.07,批间变异系数为0.03~0.11。结论 建立了基孔肯雅病毒的实时荧光定量RT-PCR定性、定量快检方法,具备较高的特异度、灵敏度与覆盖面,为定性、定量分析提供了新的技术手段。

关键词: 基孔肯雅病毒; 实时荧光定量RT-PCR; 快速检测
中图分类号:R735.7 文献标志码:A 文章编号:1009-9727(2023)02-121-06
Establishment of qRT-PCR for absolute quantitative detection of Chikungunya virus
LI Chun-yuan1,2, LIU Jiong1,2, LIU Ji-ru3, HU Xiao-yu3, CAO Meng-tao3, CHEN Yue1,2, TIAN Jing1,2, REN Rui-wen1,2, XU Xiao-li3
1. Center for Disease Control and Prevention of Southern Theater Command, Guangzhou, Guangdong 510507, China
2. Guangdong Arbovirus Diseases Emergency Technology Research Center, Guangzhou, Guangdong 510507, China
3. Instrumental Analysis & Research Center of South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China
Corresponding author:XU Xiao-li, E-mail: xuxiaoli@scau.edu.cn
Abstract

Objective To develop a real-time fluorescent quantitative RT-PCR (qRT-PCR) method for qualitative and quantitative Chikungunya virus (CHIKV) analysis.Methods Based on the systematic analysis of the genomic sequences of Chikungunya and its related arboviruses, the specific nucleic acid sequences for Chikungunya virus were screened and identified, and then the primers and TaqMan probe were designed. Meanwhile, the human GAPDH gene was used as an internal reference. The reaction system for qRT-PCR was systematically optimized by L9(34) orthogonal design, and a rapid detection method for Chikungunya by qRT-PCR based on TaqMan probe methods was established. The sensitivity, specificity, reproducibility, and coverage of the established method were analyzed in detail. The standard curve was made, and the absolute quantitative method was established using the cloned nucleic acid fragments as positive samples.Results A real-time fluorescent quantitative RT-PCR assay was developed for the qualitative and quantitative analysis of Chikungunya virus. The reaction system included Chikungunya virus and reference internal gene specific primers and probe, RT/Taq enzyme mixture, reaction buffer, and negative and positive reference. The established method obtained positive results with the ROSS strain of ECSA subtype, LR2006 strain of IOL branch, 181/25 strain of Asian type and Dongguan 2010 epidemic strains of Chikungunya virus, but there was no cross-reaction with other 18 arboviruses belonging to Flaviviruses, Alphaviruses and Bunyavirus. The minimum detection limit of the established method was 5.80 copies/mL, and a linear relationship was observed between the amount of input plasmid DNA and fluorescence signal value over a range of 5.80×102 copies/mL to 5.80×1010 copies/mL, and the correlation coefficient was 0.999 5. The qRT-PCR amplification efficiency was 91%, and the intra-assay variations and inter-assay variations were 0.01-0.07 and 0.03-0.11, respectively.Conclusions The TaqMan qRT-PCR method developed in this study can qualitatively and quantitatively detect Chikungunya virus rapidly with specificity and sensitivity, providing a technical method for the prevention and control of this viral disease.

Keyword: Chikungunya virus; real-time quantitative RT-PCR; quick detection

基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV）, 隶属披膜病毒科甲病毒属, 为单股正链RNA病毒, 基因组全长约11 800 bp, 仅含一个血清型, 据其基因组序列可细分为3个基因亚型：西非型（West African, WAF）、中/东/南非型（East/Central/South African genotype, ECSA）、亚洲型（Asian）, 其中ESCA亚型2005年又进化出印度洋分支（Indian Ocean Linge, IOL）[1]。CHIKV主要经伊蚊叮咬在人群传播, 于1952年在非洲坦桑尼亚首次发现, 并从患者血液中分离[2], 随后于1956年从野外捕获的埃及伊蚊体内分离病毒成功3]。CHIKV主要流行于非洲、南亚和东南亚地区, 截止目前, 全球已有超过100个国家和地区发生CHIKV疫情[4]。我国云南西双版纳早在1987年即报道了首次CHIKV暴发性疫情[5], 随后于海南相继在蚊虫及蝙蝠体内分离到CHIKV[6]。1999年在云南开展的血清流行病学调查中, 在人群和鼠血清中均检测到CHIKV抗体[7]。除我国南方地区毗邻印度、东南亚等CHIKV流行区, 自2008年起, 广东、浙江、福建、河南等省份陆续有输入性CHIKV病例的报道[8, 9], CHIKV已列入我国口岸重点排查的传染病名单。2010年9月底, 广东省东莞市再次暴发CHIKV疫情, 报道实验室确诊38例, 疑似病例204例[10]。2019年瑞丽市暴发CHIKV疫情, 共确诊121例, 其中本地病例98例, 缅甸输入性病例23例[11]。种种迹象均表明, 在我国南方地区, 不仅存在CHIKV流行的条件及输入性传播的可能, 也可能已存在局部流行, 对我国热区的公共卫生安全造成威胁。建立针对病毒快速准确的病毒拷贝数定量检测方法, 也可为临床治疗和预后提供重要参考依据, 对于该类疾病的临床诊断、流行病学调查与疫情防控具有重要意义。

1 材料与方法
1.1 毒株

实验中所用CHIKV ECSA亚型ROSS株（GenBank登录号, 下同。GenBank: AF369024.2）、IOL分支LR2006株（GenBank: DQ443544.2）, 亚洲型181/25株（GenBank: MW473668.1）, 其他参考毒株：黄病毒科（Flaviviruses）登革1型病毒Hawaii株（Dengue virus type 1, DV1, GenBank: KM204119.1）、登革2型病毒NGC株（Dengue virus type 2, DV2, GenBank: MK506264.1）、登革3型病毒H87株（Dengue virus type 3, DV3, GenBank: M93130.1）、登革4型病毒H241株（Dengue virus type 4, DV4, GenBank: KR011349.2）、流行性乙型脑炎病毒中山株（Japanese encephalitis virus, JEV, GenBank: EF571853.1）、黄热病毒17D株（Yellow Fever virus, YFV, GenBank: MT505351.1）、西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV, GenBank:AM404 308.1）、兰格特病毒TP21株（Langat virus, Lan, GenBank:EU790644.1）、寨卡病毒（Zika virus, zikaV, GenBank: NC_012532.1）、森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV, GenBank:KU885457.1）, 甲病毒属（Alphavirus）辛德毕斯病毒（Sindbis virus, SINV, GenBank: KT121618.1）、盖塔病毒（Getah Virus, GETV, GenBank: EF011023.1）、罗斯河病毒（Ross river virus, RRV, GenBank: M20162.1）、鹭山病毒（Sagiyama virus, SAGV, GenBank: AB032553.1）、西门利克病毒（Semliki Forest virus, SFV, GenBank: NC_00321 5.1） 、马雅罗病毒（Mayaro virus, MAYV, GenBank: NC_003417.1）, 布尼安病毒科（Bunyavirus）巴泰病毒（Batai virus, BATV, GenBank: NC_043580）、布尼安姆韦拉病毒（Bunyamwera virus, BUNV, GenBank:D00353.1）, 均由本研究室传代保存。序列分析所用其他毒株序列来自GenBank核酸数据库。

1.2 主要试剂

Trizol RNA提取试剂、荧光定量RT-PCR试剂盒（Superscript Ⅲ One-Step RT-PCR with Platinum Taq）购自Invitrogen公司, T4 DNA连接酶、DH5α 感受态细胞、一步法反转录试剂盒（One Step PrimeScript RT-PCR）及pMD20-T vector均购自Takara公司, 凝胶纯化回收及质粒快速提取试剂购自Omega公司。1640细胞培养液及胎牛血清购自Gibco公司。

1.3 引物、探针设计

检索GenBank核酸数据库, 收集各型CHIKV流行株, 以及甲病毒、黄病毒、布尼安病毒属相近虫媒病毒全基因组序列, Clustalx比对分析, 兼顾序列特异度及覆盖面, 确定检测目标序列, 并参考人GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）管家基因核酸序列, 采用Primer Premier 6.0软件分别设计CHIKV及人GAPDH内参引物、探针（表1, 图1）, 引物、探针由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物与探针 Table 1 The primers and probes

图1 qRT-PCR引物、探针比对分析图Fig. 1 Comparison and analysis results of qRT-PCR primers and probes

1.4 RNA提取及阳性标准品制备

取相应病毒细胞培养物200 μ L, 按试剂操作说明Trizol法提取总RNA, 用50 μ L TE buffer 溶解。于检测靶标上下游分别延伸300~500 bp设计上、下游引物CHIKVF、CHIKVR, 并在引物5'末端添加T7启动子（表1）, RT-PCR扩增目标片段, 克隆入pMD20 T载体, 转化DH5α 宿主菌, 并小量制备质粒, 数字PCR绝对定量分析测定其拷贝数, 用作实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测的阳性品及定量分析标准品。

1.5 qRT-PCR反应条件优化

针对影响qRT-PCR反应的RT/Taq DNA聚合酶、Buffer缓冲液、上下游引物、探针浓度, 选用L9（34）正交表进行正交设计（表2）, 进行4因素3水平正交实验对qRT-PCR反应体系进行优化, 9个处理组各重复3次, 并对qRT-PCR反应条件进行系统优化, qRT-PCR反应在Bio RAD CFX96型实时荧光定量PCR仪上进行。

表2 实时荧光定量RT-PCR反应中各影响因素水平 Table 2 The level of influencing factors in real-time fluorescence quantitative RT-PCR reaction
1.6 qRT-PCR方法灵敏度评估

阳性参考质粒设置5.80× 101~5.80× 106拷贝/mL 6个稀释梯度, 每个梯度设置3个重复, 分别以优化条件进行qRT-PCR扩增, 评估快检方法的最低检出限。

1.7 qRT-PCR 方法特异度评估

采用优化条件, 对CHIKV ECSA亚型ROSS株、WJ0601株, IOL亚型LR2006株, 2010年东莞CHIKV患者标本, 并以其他18种相近虫媒病毒为阴性对照, 以无模板样品为空白对照, 进行检测方法特异度及覆盖面评估。

1.8 qRT-PCR 方法定量准确性评估

以阳性参考质粒5.80× 102~5.80× 1010 拷贝/mL 9个稀释梯度, 以优化条件进行实时荧光定量RT-PCR扩增, 并绘制标准曲线。待定量质粒样品分别设置1.68× 104、6.70× 105、4.19× 106、6.70× 106、4.19× 107、1.68× 108、1.68× 1010、1.68× 1011 拷贝/mL 8个浓度, 3重复3反应, 分析所建立qRT-PCR方法定量分析的准确性与批内、批间稳定性。

2 结果
2.1 CHIKV阳性参考品制备

CHIKV阳性品核酸片段经RT-PCR扩增后, 克隆入pMD20 T载体, 转化DH5α 宿主菌, 并小量制备质粒, 经PCR及测序确认无误。微量核酸测定仪测定浓度后, 根据公式计算拷贝数为5.80× 1010 拷贝/μ L。

2.2 qRT-PCR反应条件优化正交试验

结果显示酶、缓冲液、上下游引物（FR）及探针（Probe）均对检测方法的灵敏度具显著影响（P< 0.01）, 其影响的显著性顺序为：探针> FR> 酶> 缓冲液, 即探针对检测灵敏度影响最大（表3）。经系统优化, 获最优反应体系：总反应体系25 μ L, 含病毒RNA模板5.0 μ L, RT/Taq Enzyme 0.6 μ L（5 U/μ L）, 2× Buffer缓冲液12.5 μ L, CHIKV及内参GAPDH上、下游引物各0.15 μ mol/L、探针各 0.2 μ mol/L; RT-PCR反应条件：50 ℃, 10 min, 95 ℃, 3 min, 1个循环; 95 ℃, 5 s, 56 ℃, 30 s, 并于56 ℃延伸后收集荧光信号, 40循环; 37 ℃ 2 min, 1循环。在优化条件下, 所建立qRT-PCR反应可获典型S型扩增曲线, 荧光信号稳定, 空白对照无扩增, 检测重复性佳, 表明所建立的qRT-PCR方法可用于CHIKV的检测。

表3 方差分析表 Table 3 Analysis of variance
2.3 qRT-PCR方法灵敏度评估

在CHIKV阳性品质粒5.80× 102~5.80× 106 拷贝/mL范围内, qRT-PCR反应均可获阳性结果, 其Ct值介于19.86~34.47之间, 而当阳性品质粒浓度低于5.80× 101 拷贝/mL时, 检测Ct值低于35, 分析表明所建立qRT-PCR方法检测下限为580 拷贝/mL（图2A）。

图2 qRT-PCR方法灵敏度与特异度评估
A.灵敏度评估; B.特异度评估。Fig. 2 Fluorescence quantitative sensitivity and specificity experiment
A. Assessment of sensitivity; B. Assessment of specificity.

2.4 qRT-PCR方法特异度与覆盖面评估

优化条件下, 所建立方法对CHIKV ECSA亚型ROSS株、WJ0601株, IOL亚型LR2006株, 2010年CHIKV东莞流行株均可获得阳性扩增, 扩增反应具明显的S型扩增曲线, 而与其他18种相近虫媒病毒均无扩增, 表明所建立方法具备较高检测特异度（图2B）。

2.5 qRT-PCR方法定量准确性评估

CHIKV阳性质粒经5.80× 102~5.80× 1010 拷贝/mL梯度稀释后, 分别用所建立方法进行扩增, 得到标准曲线为Y= -3.571X+42.57, R2=0.999 5, 扩增效率为E=0.91%。对8组待定量质粒样品的定量分析表明, 其批内变异系数（coefficient variations of intra-assay）介于0.01~0.07之间, 批间变异系数（coefficient variations of inter-assay）介于0.03~0.11之间, 表明所建立方法具备较好定量分析准确性与重复性。见图3。

图3 qRT-PCR绝对定量标准曲线
A. qRT-PCR定量分析扩增曲线; B. qRT-PCR定量分析标准曲线。Fig. 3 Absolute quantitative standard curve for qRT-PCR methods
A. Amplification curve of qRT-PCR Quantitative analysis; B. Standard curve of quantitative analysis by qRT-PCR.

3 讨论

CHIKV传播媒介、流行季节及临床症状与黄热病、登革等虫媒传染病类似, 给临床诊断带来很大的困难。目前, CHIKV的实验室诊断主要包括病毒分离、血清学诊断及分子生物学诊断[12]。病毒分离是CHIKV感染诊断的金标准, 但对人员及实验条件要求较高, 且检测周期长, 分离率较低, 难以作为常规检测方法。CHIKV的血清学检测方法研究较多, 主要包括免疫层析法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫杂交法、血凝抑制法、病毒中和实验等[13], 但目前针对抗原的血清学检测方法研究较少, 针对抗体的检测存在检测“ 窗口期” , 并且受假阳性影响较大, 在临床检测上不占优势。相对于血清学检测, qRT-PCR方法灵敏度、特异度均大大增强, 受“ 窗口期” 影响小, 且容易实现自动化、高通量检测, 已成为目前实验室病原体早期检测的首选方法。CHIKV的qRT-PCR快检方法国内外学者已有多项报道研究, 检测靶标主要集中于E1、3'UTR等高保守区[14, 15, 16], 需要筛选靶向病毒极早期基因的核酸检测方法, 尽量缩短病毒感染“ 窗口期” 对检测的影响, 以达到早期诊断目的。

CHIKV感染后临床症状为发热、寒战、关节疼痛、恶心和皮疹等, 病情进展迅速, 可导致患者关节功能丧失, 恢复期较为漫长, 对患者生活及工作带来很大的影响[4]。20世纪60年代以来, CHIKV流行逐渐东移至东南亚地区, 我国毗邻的印度、缅甸、泰国、柬埔寨、越南、印度尼西亚、马来西亚和斯里兰卡等国家均已有该疫情的广泛传播[17]。我国与该区域人员、经济往来频繁, 自2008 年检出首例输入性 CHIKV患者后, 迄今已检出数十例输入性CHIKV病例[8, 9], 2010、2019年在广东东莞、云南瑞丽分别暴发生小规模社区疫情[10, 11], 该病输入并流行的风险正在加剧。血清流行病学调查[18]表明, 云南省健康人CHIKV 抗体阳性率为 6.93%、恒河猴为2.45%、猪为4.06%。并已有证据表明, 我国已存在蚊虫媒介及 CHIKV 的自然循环[18, 19]。我国东南各省媒介伊蚊分布广泛, 气候条件与CHIKV流行区相似, 引起较大规模CHIKV疫情的风险较高[20]。因此, 建立一套快速而有效的CHIKV实验室诊断方法, 加强CHIKV的监测, 对防止该病的输入与流行具有非常重要的现实意义。

本研究基于CHIKV NSP4基因建立其qRT-PCR快检方法, 具较高灵敏度, 且NSP4蛋白为RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase）, 为病毒极早期反应蛋白[20], 病毒感染数小时后可被检出, 可有效降低核酸检测的窗口期影响, 达到早期诊断目的。与此同时, 由于各类虫媒病毒之间具备较高的序列相似性, 核酸检测中容易产生交叉反应, 研究团队在长期科研过程中, 收集了较为全面的虫媒病毒标准毒株及地方流行株, 从而可对检测方法的特异度进行较为系统的分析验证, 从而确保了所建立方法的特异度、灵敏度。由于CHIKV为小RNA病毒, 具备较高的突变率, 核酸检测覆盖面往往受到限制。本研究引物设计过程中, 详细分析了各虫媒病毒基因组序列, 使所建立检测方法具有较好的覆盖面。实验结果表明, 所建立qRT-PCR方法检测下限达5.80× 102 拷贝/mL, 与ECSA亚型、IOL分支、亚洲型等CHIKV主要型别均可获得阳性结果, 且与常见虫媒病毒无交叉反应, 为该类疾病的定性、定量分析提供了新的技术手段。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

编辑：黄艳

参考文献
[1] 李力, 谢彤, 李晓燕. 基孔肯雅病毒的分子变异及其流行趋势[J]. 中国热带医学, 2021, 21(8): 809-813.
LI L, XIE T, LI X Y. Molecular variation and epidemiology of the Chikungunya virus[J]. China Trop Med, 2021, 21(8): 809-813. (in Chinese) [本文引用:1]
[2] ROSS R W. The Newala epidemic. III. The virus: isolation, pathogenic properties and relationship to the epidemic[J]. J Hyg (Lond), 1956, 54(2): 177-191. [本文引用:1]
[3] CAGLIOTI C, LALLE E, CASTILLETTI C, et al. Chikungunya virus infection: an overview[J]. New Microbiol, 2013, 36(3): 211-227. [本文引用:1]
[4] 施华芳, 张海林, 自登云, 等. 云南首次从患者体内分离到基孔肯雅病毒[J]. 中国人兽共患病杂志, 1990, 6(1): 2-4, 2.
SHI H F, ZHANG H L, ZI D Y, et al. Chikungunya virus was first isolated from the patient in Yunnan Province[J]. Chin J Zoonoses, 1990, 6(1): 2-4, 2. (in Chinese) [本文引用:2]
[5] 董必军, 陈文州, 李秀维, 等. 首次从海南岛蚊虫和蝙蝠中分离出两株基孔肯雅病毒[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 1993, 4(3): 205-208.
DONG B J, CHEN W Z, LI X W, et al. Two isolates of Chikungunya virus isolated from Culex fatigans and bats, for the first time in Hainan, China[J]. Chin J Vector Biol Control, 1993, 4(3): 205-208. (in Chinese) [本文引用:1]
[6] 陶三菊, 张海林, 杨冬荣, 等. 云南省澜沧江下游地区虫媒病毒的调查研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2003, 17(4): 322-326, F002.
TAO S J, ZHANG H L, YANG D R, et al. Investigation of Arboviruses in Lancang River down-stream area in Yunnan Province[J]. Chin J Exp Clin Virol, 2003, 17(4): 322-326, F002. (in Chinese) [本文引用:1]
[7] ZHENG K, LI J D, ZHANG Q F, et al. Genetic analysis of chikungunya viruses imported to mainland China in 2008[J]. Virol J, 2010, 7: 8. [本文引用:1]
[8] 曹国平, 钟建跃, 郑灿杰, 等. 浙江省衢州市基孔肯雅热疫情流行病学研究[J]. 中国预防医学杂志, 2019, 20(1): 17-20.
CAO G P, ZHONG J Y, ZHENG C J, et al. The epidemiological features of chikungunya fever outbreak in Quzhou, Zhejiang Province[J]. Chin Prev Med, 2019, 20(1): 17-20. (in Chinese) [本文引用:2]
[9] WU D, WU J, ZHANG Q L, et al. Chikungunya outbreak in Guangdong Province, China, 2010[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(3): 493-495. [本文引用:2]
[10] 尹小雄, 刘永华, 张海林, 等. 2019年云南中缅边境基孔肯雅热暴发疫情的流行病学特征[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2020, 34(6): 600-604.
YIN X X, LIU Y H, ZHANG H L, et al. An outbreak of Chikungunya fever in Yunnan Province near the China-Myanmar border in 2019[J]. Chin J Exp Clin Virol, 2020, 34(6): 600-604. (in Chinese) [本文引用:2]
[11] WANG Y J, ZHANG Y B, DUAN X Y, et al. Progresses on diagnostic techniques on Chikungunya virus infection[J]. Chin J Clinl Lab Sci, 2012, 30(7): 522-524. [本文引用:2]
[12] 林苗, 吕志平, 王宝麟. 基孔肯雅热[M]. 北京: 中国标准出版社, 2010. [本文引用:1]
[13] 黄吉城, 郑夔, 李小波, 等. 基孔肯雅病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(9): 1721-1723.
HUANG J C, ZHENG K, LI X B, et al. Study on real time RT-PCR detection method for Chikungunya virus[J]. Chin J Health Lab Technol, 2008, 18(9): 1721-1723. (in Chinese) [本文引用:1]
[14] SMITH D R, KULESH D A, JAHRLING J, et al. Development of field-based real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assays for detection of chikungunya and O'nyong-nyong viruses in mosquitoes[J]. Am J Trop Med Hyg, 2009, 81(4): 679-684. [本文引用:1]
[15] 郑丽兰, 冯海欢, 陈鑫华, 等. CHIKV Real-time PCR检测方法的建立及试剂盒研发[J]. 中国热带医学, 2018, 18(4): 345-350.
ZHENG L L, FENG H H, CHEN X H, et al. Establishment of CHIKV real-time PCR detection method and diagnostic kit[J]. China Trop Med, 2018, 18(4): 345-350. (in Chinese) [本文引用:1]
[16] POWERS A M, BRAULT A C, TESH R B, et al. Re-emergence of Chikungunya and O'nyong-nyong viruses: evidence for distinct geographical lineages and distant evolutionary relationships[J]. J Gen Virol, 2000, 81(Pt 2): 471-479. [本文引用:1]
[17] 张海林, 施华芳, 刘丽华, 等. 从云南省蝙蝠中分离基孔肯雅病毒及血清抗体调查[J]. 病毒学报, 1989, 5(1): 31-36.
ZHANG H L, SHI H F, LIU L H, et al. Isolation of chikungunya virus from bat in Yunnan Province and serological investigations[J]. Chin J Virol, 1989, 5(1): 31-36. (in Chinese) [本文引用:1]
[18] 张云智, 张海林, 米竹青. 云南白纹伊蚊感染和传播基孔肯雅病毒的研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 1996, 7(2): 122-124.
ZHANG Y Z, ZHANG H L, MI Z Q. Infection and transmission of chikungunya virus in Yunnan strain of Aedes albopictus[J]. Chin Journul Vector Biol Contral, 1996, 7(2): 122-124. (in Chinese) [本文引用:2]
[19] 郭汝宁, 彭志强, 宋铁, 等. 广东省1990—2012年登革热和基孔肯雅热感染状况及流行风险分析[J]. 中华流行病学杂志, 2014, 35(2): 167-169.
GUO R N, PENG Z Q, SONG T, et al. Current infection status and epidemic risk analysis of Dengue fever and Chikungunya in Guangdong Province, from 1990 to 2012[J]. Chin J Epidemiol, 2014, 35(2): 167-169. (in Chinese) [本文引用:1]
[20] PIETILÄ M K, HELLSTRÖM K, AHOLA T. Alphavirus polymerase and RNA replication[J]. Virus Res, 2017, 234: 44-57. [本文引用:2]