3.1.1 直接电穿孔环状体法 直接通过电穿孔方式将外源DNA转入到环状体（EiRBC method）^{[23, 24]}, 即对早期环状体感染的红细胞（red blood cell, RBC）（5%~10%原虫感染率）培养物（100 µ L）进行单次转染。用cytomix（10 mmol/L K₂HPO₄/KH₂PO₄、120 mmol/L KCl、0.15 mmol/L CaCl₂· 2H₂O、25 mmol/L HEPES、2 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgCl₂· 6H₂O, pH 7.6）悬浮洗涤, 再混合含有100 µ g质粒DNA（最终体积：400 µ L）。将悬浮液转移到冷却的0.2 cm比色皿中, 并使用Bio-Rad GenePulser Xcell™ 进行脉冲（0.31 kV、950 µ F和无限Ω ）。电穿孔后的疟原虫用完全培养基洗涤1次, 然后置于标准条件中进行培养。

3.1.2 预加载法（preloading method） 预加载法^{[9, 14, 16, 25, 26]}是通过电穿孔红细胞, 把质粒转入到红细胞内, 然后用此红细胞来培养疟原虫, 即电转后, 加入裂殖体期的疟原虫, 让疟原虫感染这些DNA预加载的红细胞来提高转染效率。新鲜红细胞（150 µ L）用cytomix洗涤, 然后重新悬浮在含有50 µ g质粒DNA（最终体积：420 µ L）的cytomix中。将混合物转移到0.2 cm比色皿（Bio-Rad）中, 在冰上冷却, 并使用Bio-Rad GenePulser Xcell™ 进行脉冲（0.31 kV、950 µ F和无限Ω ）。然后用在4 ℃条件下预冷的培养基洗涤载有质粒DNA的红细胞, 并与纯化的裂殖体期疟原虫（2%~3%的感染率）进行混合培养。

3.2.1 电穿孔法：外源DNA转入环状体 直接将DNA通过电穿孔方式转入恶性疟原虫环状体的过程是采用Amaxa 4D电穿孔仪（Lonza）和P3原代细胞4D-Nucleofector^TM X Kit L （Lonza）进行的。每次转染时, 在100 μ L补充的P3原代细胞溶液中加入10 μ L DNA （10 μ g/μ L）。取100 μ L的红细胞（疟原虫环状体期感染率为10%）用cytomix洗涤, 然后悬浮于DNA和P3原代细胞液中, 使用FP158、CM150或CM162程序在4D-Nucleofector^TM X Kit L比色皿（Lonza）中进行电穿孔。电穿孔后, 立即用37 ℃预热的完全培养基清洗疟原虫, 去除破碎的红细胞, 并加入10 mL完全培养基进行培养^[26]。

3.2.2 电穿孔法：外源DNA转入成熟裂殖体 当培养物中绝大多数疟原虫发育到裂殖体阶段时, 使用Percoll梯度溶液对其进行富集纯化。将10 μ L的DNA （10 μ g/μ L）样品（即供体质粒和含有sgRNA的质粒）溶解在100 μ L Parasite Nucleofector Ⅱ 溶液（Lonza）和10~20 μ L纯化的裂殖体 （1.0× 10⁸）中。并立即使用FP158、CM150或CM162程序在4D-Nucleofector^TM X Kit L（Lonza）中进行电穿孔。电穿孔后立即将转染的疟原虫与0.1 mL完全培养基混合, 然后在 5 mL含有新鲜红细胞的完全培养基中培养^{[7, 22, 26, 27]}。

该方法不需要电转仪^[23], 取50%压积的新鲜红细胞重悬于RBC储存介质中（1:2）, 离心洗涤。重复1次后再将沉淀重悬于等体积的RBC储存介质中, 于4 ℃放置。将上述RBC悬浮液（约200 μ L）用1 mL冰冷的PBS洗涤2次, 并小心除去上清液。再将沉淀重悬于100 μ L预冷的RBC裂解缓冲液（含有100 μ g质粒DNA的预冷RBC裂解缓冲液）中, 并在4 ℃下温和旋转孵育1 h。估计RBC悬浮液的体积和再密封溶液储备（5 mol/L NaCl, 1 mol/L MgCl₂, 100 mmol/L ATP, 100 mmol/L GSH）的体积, 再密封溶液适当添加以达到重新密封缓冲液浓度（150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl₂, 1 mmol/L ATP和1 mmol/L GSH）。将该悬浮液在37 ℃、55 r/min摇动速度下孵育1 h。重新密封的RBC悬浮液10× PCV的RBC储存介质（预热至37 ℃）洗涤2次, 将洗涤后的重新密封的RBC沉淀（重新密封的红细胞被称为裂解-重新密封红细胞）悬浮在等体积的RBC储存介质中以供后续使用或在4 ℃下储存直至下次使用。最后加入纯化的滋养体/裂殖体阶段虫体以达到2%~3%的原虫血感染率, 并在标准条件下进行培养^[23]。

GOVINDARAJALU等^[23]为了研究转染方法是否对质粒的摄取效果产生影响, 同时采取直接电穿孔环状体, 预载法以及裂解-再封闭红细胞的方法对疟原虫进行稳定转染。研究发现直接电穿孔环状体和裂解-再密封红细胞法对质粒的转染几乎是100%转染且普遍适用, 而预载法对一些虫株的转染并未筛选成功, 考虑可能是方法的局限性或者质粒DNA的不同导致转染失败。原因可能是恶性疟原虫的环状体期比裂殖体期被更多的红细胞胞质包围, 前者占据相对较小的RBC细胞质体积, 而后者在消化大部分血红蛋白后填满细胞, 因此直接电穿孔环状体法产生的转基因信号要比预载法更加强烈, 成功率略高（Bio-Rad GenePulser Xcell™ ）。

此外, 对于新的转染方法, GOVINDARAJALU等本着经济简单的原则, 在原重新密封红细胞转染恶性疟原虫的方法上进行了改进, 最大程度地掺入重新密封的红细胞中的裂解物蛋白含量。重新密封的红细胞中的蛋白质含量占RBC裂解物总蛋白质含量的约53%。结果表明, 抗性疟原虫出现的时间相对直接电穿孔环状体而言有一定的延迟, 考虑可能是新方法中的疟原虫必须从RBC胞质溶胶中吸收DNA, 而不是直接将DNA分子电穿孔到疟原虫内^[23]。

再者, WANG等^[26]对疟原虫转染效率进行比较研究, 发现采用Bio-Rad Gene Pulser Xcell^TM进行质粒预加载未感染红细胞的转染效率最高, 是使用Lonza 4D-Nucleofector转染环状体疟原虫方法的2倍。采用Lonza 4D-Nucleofector方法分别对环状体和裂殖体期疟原虫进行转染, 发现转染环状体比裂殖体效率更高。此外, 该研究还评估了一种使用Nucleofactor系统转染裂殖体的方法, 考虑了完成药物筛选实验所需的效率和时间, 证实了预加载方法效率更高, 但Nucleofactor对环状体期疟原虫的转染方法在CRISPR/Cas9编辑后完成药物选择实验所需的时间更少^[26]。综上, 就转染成功率、重组疟原虫的药物筛选时间（30 d左右）以及质粒的摄取效率综合来看, 预载法仍是目前公认的最佳方法^[9]。

尽管GOVINDARAJALU等^[23]实验结果表明了使用Bio-Rad GenePulser Xcell™ 方法对疟原虫环状体直接进行电穿孔的成功率极高, 但考虑到转染对细胞以及疟原虫的损伤程度以及重组疟原虫筛选的时间, 大多研究员依旧以预载法作为首选方法, 可能有以下几个原因：①有实验观察到疟原虫吸收多个质粒的倾向与预加载法和环状体阶段转染方法相似, 可能是因为这两种方法最终都可能通过某种类似的机制将DNA递送到寄生虫中^[20]; ②预载法转染疟原虫相比直接电穿孔法可能降低了电流刺激对虫体的伤害, 增加疟原虫的生存率而有利于基因的整合^[22]。除了以上转染方法的选择会影响转染的成功率, 转染条件的设置以及转染环境也是关键因素。

大多数恶性疟原虫的转染实验需要50~100 µ g质粒DNA, 若采用低质量的质粒DNA（≤ 2.5 μ g）进行转染, 大多会产生不稳定的恶性疟原虫虫株并且在较高选择压力下被消除^{[23, 26]}。

已经证实：在电穿孔时, 细胞对介质的渗透压和离子组成都很敏感^[28], 精确的跨膜电压非常依赖转染试剂的盐浓度和缓冲条件^[29]。

疟原虫的转染效率对参数设置的微小变化极为敏感, 例如：电压不足不能完全透化细胞膜, 从而降低转染效率; 而过高的电压又会导致不可逆的细胞损伤。对于Bio-Rad GenePulser Xcell™ 常规电穿孔, 通常选择0.31 kV、950 μ F（0.2 cm比色皿）作为最优电穿孔条件^[30]。通过比较Lonza 4D-Nucleofector细胞核转染参数, 分别使用CM150和CM162程序进行转染, 发现原虫感染率没有显著性差异（P> 0.05）^[26]; 而FP158程序对疟原虫的生长造成的损害更大, 存活率降低了至少50%^{[26, 31]}。

构建的分别含有WR99210以及BSD （Blasticidin S hydrochloride）抗性基因的质粒, 在转染后需要根据标准方法在37 ℃和气体（5% O₂, 5% CO₂和90% N₂）条件下进行培养和药物筛选, 所使用的红细胞不应超过6周, 因为衰老红细胞中的疟原虫增殖通常会减少^[25]。由于转染后的疟原虫对BSD和WR99210^[31]的抗性增加了4 000倍, 以此可筛选出有抗性的重组虫株^{[9, 23, 31, 32, 33]}。转染成功与否可通过报告基因的表达水平来衡量, 目前一般认为在药物选择后疟原虫持续生长, 转染才被视为成功^[7]。但是, 在移除药物筛选后, 疟原虫培养90 d便可发生质粒丢失并恢复对WR99210和BSD的敏感性。